W010755 Курсовая работа Цианокобаламин

Содержание

Реферат 2

Введение 4

1. Строение цианокобаламина 5

2. Физические свойства 10

3. Химические свойства 11

3.1 Отношение к нагреванию 11

3.2 Гидролиз 12

3.3 Окисление 12

3.4 Галогенирование 13

3.5 Гидрирование 14

3.6 Реакция с синильной кислотой 15

3.7 Реакция замещения циангруппы различными лигандами 15

4. Биологически активные свойства цианокобаламина 17

5. Получение и применение витамина B12 22

6. Псевдовитамины, производные и аналоги B12 29

6.1 Псевдовитамины 29

6.2 Производные с другими лигандами 29

6.3 Аналоги 31

7. Определение витамина В12 33

Опыт 1. Открытие кобальта в цианокобаламине. 33

Опыт 2. Идентификация и количественное определение цианокобаламина в растворе. 33

Опыт 3. Капельный метод обнаружения. 34

Опыт 4. Фотометрический метод. 34

Заключение 35

Список использованной литературы 36

Введение

Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток

того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные

процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Витамины не образуются у гетеротрофов.

Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в

частности растения. Многие микроорганизмы также образуют целый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основой для разработки технологий промышленного производства этих биологически активных соединений.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов -

продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого

из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время

витаминов.

Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, В12, -каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов [1].

1. Строение цианокобаламина

Структура цианокобаламина была установлена в 1955 г., а затем подтверждена синтезом, осуществленным в 1972 г. Р. Вудвордом в США и Н. Эшенмоэером в Швейцарии. Молекула цианокобаламина состоит из двух связанных между собой частей: кобальтового комплекса нуклеотида бензимидазола и макроциклической корриновой системы, т.е. представляет собой Со-[-(5,6-диметилбензимидазолил)]-Со-цианокобамид [2] (Рисунок 1):

Рисунок 1 – Строение цианокобаламина

В молекуле цианокобаламина содержится около 4,5% кобальта, т. е. один атом, что доказано спектроскопически [3, 4]. Присутствие в цианоко- баламине циан-иона установлено на основании образования и выделения цианистого водорода при нагревании витамина в растворе соляной или щавелевой кислоты [5]. Выделения синильной кислоты не происходит, если гидролиз производить в растворе серной кислоты, имеющей малую склонность к образованию координационной связи.

При кислотном гидролитическом расщеплении витамина В12 при 100°С в 20%-ной соляной кислоте в запаянной трубке, помимо отщепления синильной кислоты, выделяется одна молекула фосфорной кислоты [6], шесть молекул аммиака [6, 7] и вещество, обнаруженное в виде пятна на бумажной хроматограмме, дающее положительную реакцию с нингидрином [6, 7].

Большие трудности представила идентификация этого так называемого «нингидрин-реагирующего» вещества, отделяемого хроматографией на бумаге от других продуктов кислотного гидролиза витамина В12. Этот алифатический осколок не являлся аминокислотой, и его нельзя было отделить от искусственной смеси с 2-амннопропанолом-1. Однако хроматографией на бумаге его нельзя было отделить и от 1-аминопропанола-2 [7]. Так как 2-аминопропанол-1 при окислении дает -аланин, а «нингидрин-реагирующее» вещество аланина не дает, то вопрос об их идентичности отпал.

«Нингидрин-реагирующее» вещество оказалось D-1-аминопропанолом-2, что было установлено структурным анализом и синтезом [8]. Из кислотного гидролизата цианокобаламина D-1-аминопропанол-2 [8, 9] был выделен в виде дибензоата с т. пл. 73-74°С. Строение свободного амина доказано реакцией его расщепления йодной кислотой до ацетальдегида и формальдегида. Установлено [7], что в цианокобаламине присутствует только одна молекула D-1- аминопропанола-2.

Другим осколком молекулы цианокобаламина в результате жесткого кислотного гидролиза в 6 н. соляной кислоте при 150°С в течение 20 ч [10]   оказался 5,6-диметилбензимидазол с т. пл. 205—206°С [10-12], идентифицированный по спектру поглощения [11].

Таким образом, нуклеотид включает следующие связанные между собой структурные элементы: 5,6-диметилбензимидазол, -D-рибофуранозы фосфат (фосфорный эфир -D-рибозы) и D-1-аминопропанол-2 (Рисунок 2):

Рисунок 2 (слева направо) - 5,6-диметилбензимидазол; -D-рибофуранозы фосфат; D-1-аминопропанол-2

Нуклеотид соединен с корриновой системой пептидной связью. Атом азота 5.6-диметилбензимидазола в положении 3 связан координационной связью с атомом кобальта (). Кобальт образует хелатное (внутрикомплексное) соединение с цианогруппой и с атомами азота гидрированных пиррольных циклов корриновой системы. Таким образом, создается замкнутая (с одной стороны - валентной, а с другой - ковалентной связью), циклическая система, в центре которой находится координационный атом кобальта (координационное число 6).

Положительный заряд иона кобальта нейтрализуется отрицательно заряженным анионом фосфорной кислоты (содержащейся в D-рибофуранозе). Поэтому цианокобаламин представляет собой не только хелатное соединение, но и внутреннюю соль или диэфир фосфорной кислоты, у которого одна связь - с рибозой, а другая - с пропионильным остатком кобамида.

Макроциклическая планарная корриноная система включает четыре частично или полностью гидрированных пиррольных цикла. Они соединены между собой по ,-положениям циклов A-В, В-С и С-D тремя мезо-углеродными атомами и одной непосредственной ,-связью между циклами А и D. Корриновая система имеет шесть сопряженных двойных связей и девять асимметрических атомов углерода (Рисунок 3):

Корриноная система цианокобаламина включает шесть амидных групп (три ацетамидные и три пропионамидные), а также восемь метильных групп. Цианогруппа и остаток 5,6-димелбензимидазолилриботида занимают в молекуле аксиальное положение по отношению к корриновой системе [2].

Рисунок 3 – Коррин

 Таким образом, на основании химических данных и физических методов исследования можно считать доказанным, что в молекулу цианокобаламина включаются фосфорная кислота, D-рибоза и 5,6-диметилбензимидазол, образующие фосфорный эфир 1--D-рибофуранозил-5,6-диметилбензимидазола; этот нуклеотид связан фосфорноэфирной связью с 1-аминопропанолом-2, который в свою очередь связан амидной связью с карбоксильной группой остальной части молекулы, содержащей кобальтовый комплекс, образующий координационную связь с циклическим атомом азота бензимидазола и с нитрильной группой.

 Вследствие большой молекулярной массы цианокобаламина — 1355,5 [13] определить его элементарный состав представляло большие трудности; предлагались различные эмпирические формулы [14, 15]. Цианокобаламин имеет элементарный состав C63H88N14014PCo [16]. Молекулярная масса его определялась по повышению температуры кипения [14] и рентгенострук-турным анализом [13].

2. Физические свойства

Цианокобаламин, -(5,6-диметилбензимидазолил) кобамид цианид - витамин В12 - кристаллизуется в рубиново-красных иглах или приз¬мах орторомбической системы (из водного ацетона); он содержит 14-17% во¬ды, которая удаляется в вакууме при 100°С. Безводный витамин гигро¬скопичен (поглощает около 12% влаги). Он достаточно стабилен.

Цианокобаламин не имеет четко выраженной температуры плавления: при температуре выше 200°С он начинает постепенно темнеть и разлагаться, но не плавится до 320° С [3]. Цианокобаламин относительно легко растворяется в воде (1,25% при 25°С), образуя растворы с нейтральной реакцией, а также в метиловом и этиловом спиртах, в уксусной кислоте, феноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, нерастворим во многих неполяр¬ных органических растворителях, например в хлороформе, ацетоне, бен¬золе, пиридине и эфире. Водные растворы наиболее устойчивы при pH 4-7. Удельное вращение []235553 - 59±9° [17] и []206438 - 110±10° (1,98 мг в 0,4 мл воды) [14].

Спектр поглощения цианокобаламина в ультрафиолетовом и видимом свете, измеренный в водном растворе или в растворе метилового спирта, имеет максимумы: 278, 361, 525 и 550 нм ( 115, 204, 57 и 63 соответственно) [14, 18]. Максимум поглощения при 278 нм, повидимому, от¬носится к бензимидазольной части молекулы. В других полосах спектра наблюдается некоторое подобие спектру поглощения порфирина [6]. При спектрофотометрическом анализе цианокобаламина соотношение аб¬сорбции должно быть при длинах волн (нм): 361/278 как 1,70-1,90 и 361/550 как 3,15-3,40. Спектр поглощения цианокобаламина измерен в инфракрас¬ной области [5].

3. Химические свойства

Хелатный кобальтовый комплекс цианокобаламина (витамина В12) по своему характеру практически нейтрален (очень слабо основен). Цианокобаламин диамагнитен, кобальт в нем трехвалентен и обладает координа¬ционным числом 6 [19, 20]. Это подтверждается данными полярографического восстановления. Три координационные связи кобальта насыщаются тремя парами электронов атомов азота частично гидрированных пиррольных циклов, а четвертая координационная связь - атомом азота положения 3 диметилбензимидазола. Кобальт ковалентно связан с пирролидиновым кольцом и с циангруппой. Кобаламиновые комплексы очень прочны: атом кобальта нельзя удалить из них без распада всей молекулы. Фосфорный остаток нуклеотидного лиганда цианокобаламина этерифицирован, однако не полностью, так как третий гидроксил в виде аниона фос¬форной группы компенсирован положительным зарядом атома кобальта. Таким образом, витамин В12 представляет собой внутреннюю соль [21].

Цианокобаламин, однако, нельзя рассматривать в качестве природной формы. Скорее всего [22], витамин В12 в цианоформе образуется при выделении из природных источников с применением CN-ионов, так как без цианистых соединений был выделен только оксикобаламин (в щелочной среде) или аквокобаламин (в кислой среде) [22, 23].

3.1 Отношение к нагреванию

При нагревании кристаллического цианокобаламина при 100°С происходит очень медленное разложение. Нагревание его водных растворов в пределах pH 4-7 практически не вызывает разложения; в очень малых концентрациях (0,2-10 мг в 1 мл) при pH 2 происходит медленная потеря активности, а в щелочной среде, при pH 9 - быстрое расщепление (около 90% за сутки). Уже при хроматографировании на бумаге наблюдается частичное отщепление циангруппы с образованием пятна оксикобаламина. Растворы цианокобаламина неустойчивы к свету; фотолиз сопровождается отщеплением циан-иона[45].

3.2 Гидролиз

При мягком гидролизе цианокобаламина разбавленной соляной или фосфорной кислотой различной концентрации происходит постепенное частичное дезаминирование и образование моно-, ди-, три-, тетра-, пента-, гекса- и гептакарбоновых кислот с сохранением нуклеотида. Кратковременный гидролиз концентрированной соляной или хлорной кислотой при 65°С в контролируемых условиях приводит к отщеплению нуклеотида (обрзование кобинамида), а затем аминопропанола (образование кобировой кислоты) [24], причем все другие амидные группировки остаются неизменными. Продолжительный гидролиз с соляной кислотой средней крепости приводит к образованию безнуклеотидных моно-гексакарбоновых кислот (кобировой кислоты и др.), соответственно гекса-моноамидов и в конечном итоге к кобириновой кислоте, гептакарбоновой кислоте.

Жесткий щелочной гидролиз цианокобаламина сопровождается отщеплением 5,6-диметилбензимидазола и образованием дилактампента- и монолактамгексакарбоновых кислот, содержащих весь координационносвязанный кобальт [25].

Цианокобаламин (I) в водном растворе при мягком гидролизе или фотолитически [26] превращается в оксикобаламин (II) (Рисунок 4).

Рисунок 4 – Гидролиз до оксикобаламина

3.3 Окисление

При окислении перекисью водорода в кислом растворе получаются продукты, обладающие антагонистическими свойствами для Lactobacillus leichmannii в отличие от ростового действия для Euglena gracilis [27]. При окислении витамина В12 марганцовокислым калием отщепляется синильная кислота.

3.4 Галогенирование

Хлор обесцвечивает раствор цианокобаламина, однако другие галогены (Вr, J) не дают такой реакции. Промежуточный продукт хлорирования содержит 3,8% хлора и может быть выделен в виде фиолетового кристаллического вещества [28].

При действии одним эквивалентом хлора или хлорамина на витамин В12 () при pH 4 происходит окислительная циклизация (соединение IX) с последующей реакцией замещения и образованием стабильного циклического лактона -(5,6-диметил-бензимидазолил)-8-оксикобамовой кислоты (X) [28] и лишь последующее хлорирование приводит к замещению в положении 10 с образованием лактона 10-хлорвитамина В12 (XI) (Рисунок 5) [28].

Рисунок 5 – Галогенирование

При непродолжительном (10 мин) окислении кислородом воздуха витамина В12 (I) в горячем 0,1 н. щелочном растворе образуется дегидровитамин В12 (XII) [28] -(5,6-диметилбензимидазолил)-8-аминокобамовой кислоты.