K005202 Дипломная работа Особенности фармацевтического анализа

1.1. Фармацевтический анализ

1.1.1. Особенности фармацевтического анализа

Фармацевтический анализ — это наука о химической характеристике и измерении биологически активных веществ на всех этапах производства. От контроля сырья до оценки полученного лекарственного вещества, изучение стабильности  и стандартизации лекарственной формы. Фармацевтический анализ имеет свои  особенности, которые отличают его от других видов анализа. Эти особенности заключаются в анализе веществ различной химической природы. К ним относятся неорганические, органические соединения от простых алифатических до сложных природных биологически активных веществ, элементорганические, радиоактивные.  Также в фармацевтическом анализе исследуются различные концентрации анализируемых веществ. Объектами фармацевтического анализа являются не только индивидуальные лекарственные вещества, но и смеси, содержащие различное число компонентов [1] .

Фармацевтический анализ нуждается в совершенствовании из-за создания новых лекарственных средств и  повышения качества уже известных препаратов. Так же увеличиваются требования к степени чистоты лекарственных веществ и к количественному содержанию. Исходя из этого для фармацевтики необходимы не только химические методы, но и более чувствительные физико-химические методы анализа лекарственных средств. [1] .

 К фармацевтическому анализу предъявляют высокие требования. Он должен быть достаточно специфичен и чувствителен, точен по отношению к нормативам, обусловленным ГФ, ФС и другой НД, выполняться в короткие промежутки времени с использованием минимальных количеств испытуемых лекарственных средств  и реактивов.

Фармацевтический анализ в зависимости от поставленных задач включает различные формы контроля качества лекарственного средства: фармакопейный анализ, постадийный контроль производства лекарственного вещества, анализ лекарственной формы индивидуального изготовления, экспресс- анализ в условиях аптеки и биофармацевтический анализ [2] .

Выполнение фармакопейного анализа позволяет установить подлинность лекарственного вещества, его чистоту, определить количественное содержание фармакологически активного вещества или ингредиентов, входящих в состав лекарственной формы. Несмотря на то, что каждый из этих этапов имеет свою конкретную цель, их нельзя рассматривать изолированно. Они взаимосвязаны, взаимно дополняют друг друга и отражают комплексный характер оценки качества лекарственного средства. Так, например, температура плавления, растворимость, рН среды водного раствора и т.д. являются критериями как подлинности, так и чистоты ЛВ. Указанные особенности фармакопейного анализа существенно отличают его от норм и требований к методам анализа, используемых в Государственных стандартах (ГОСТ) и технических условиях (ТУ) [2] .

.

1.1.2 Критерии фармацевтического анализа

На различных этапах фармацевтического анализа в зависимости от поставленных задач имеют значение такие критерии, как избирательность, чувствительность, точность, время, затраченное на выполнение анализа, израсходованное количество анализируемого лекарственного вещества или лекарственной формы [1] .

Избирательность метода очень важна при проведении анализа смесей веществ, поскольку дает возможность получать истинные значения каждого из компонентов. Только избирательные методики анализа позволяют определять содержание основного компонента в присутствии продуктов разложения и других примесей.

Требования к точности и чувствительности фармацевтического анализа зависят от объекта и цели исследования. При испытании степени чистоты лекарственного вещества используют методики, отличающиеся высокой чувствительностью, позволяющие устанавливать минимальное содержание примесей [1].

При выполнении постадийного контроля производства, а также при проведении экспресс-анализа в условиях аптеки важную роль имеет фактор времени, которое затрачивается на выполнение анализа. Для этого выбирают методы, позволяющие провести анализ в наиболее короткие промежутки времени и вместе с тем с достаточной точностью.

Термин «точность анализа» включает одновременно два понятия: воспроизводимость и правильность полученных результатов. Воспроизводимость характеризует рассеивание результатов анализа по сравнению со средним значением. Правильность отражает разность между действительным и найденным содержанием вещества. Точность анализа у каждого метода различна и зависит от многих факторов: калибровки измерительных приборов, точности отвешивания или отмеривания, опытности аналитика и т.д. Точность результата анализа не может быть выше, чем точность наименее точного измерения.

Так, при вычислении результатов титриметрических определений наименее точная цифра — количество миллилитров титранта, израсходованного на титрование. В современных бюретках в зависимости от класса их точности максимальная ошибка отмеривания около ±0,02 мл. Ошибка от натекания тоже равна ±0,02 мл. Если при указанной общей ошибке отмеривания и натекания ±0,04 мл на титрование расходуется 20 мл титранта, то относительная погрешность составит 0,2%. Приуменьшении навески и количества миллилитров титранта точность соответственно уменьшается. Таким образом, титриметрическое определение можно выполнять с относительной погрешностью +(0,2-0,3)%  [3] .

Точность титриметрических определений можно повысить, если пользоваться микробюретками, применение которых значительно уменьшает ошибки от неточного отмеривания, натекания и влияния температуры. Погрешность допускается также при взятии навески.

Отвешивание навески при выполнении анализа ЛВ осуществляют с точностью до +0,2 мг. При взятии обычной для фармакопейного анализа навески 0,5 г ЛВ и точности взвешивания ±0,2 мг относительная погрешность будет равна 0,4%. При анализе ЛФ и выполнении экспресс-анализа такая точность при отвешивании не требуется, поэтому навеску берут с точностью +(0,001-0,01) г, т.е. с предельной относительной погрешностью 0,1-1%.

Индивидуальные вещества можно определять при анализе спектрофотометрическим методом в УФ- и видимой областях с относительной погрешностью ±(2-3)%, ИК-спектрофотометрией ±(5-12)%, газожидкостной хроматографией = (3-3,5)%, полярографией ±(2-3)%, потенциометрией ±(0,3-1)%. При анализе ЛВ в многокомпонентных смесях относительная погрешность определения этими методами возрастает примерно в два раза. Сочетание хроматографии с другими методами позволяет выполнять анализ лекарственных веществ в лекарственных формах с относительной погрешностью ±(3-7)% .

Точность биологических методов намного ниже, чем химических и физико-химических. Относительная погрешность биологических определений достигает 20-30 и даже 50%. Для повышения точности в ГФ XI введен статистический анализ результатов биологических испытаний  [3] .

1.1.3 Физические свойства, используемые для установления подлинности лекарственных веществ

Испытание на подлинность — это подтверждение идентичности анализируемого лекарственного вещества (лекарственной формы), осуществляемое на основе требований Фармакопеи или другой НД (ФС, ФСП). Испытания выполняют физическими, химическими и физико-химическими методами. Свои особенности имеют испытания неорганических, элементорганических и органических лекарственных веществ.

Подлинность лекарственного вещества подтверждают показатели: описание внешнего вида, его физические свойства, физические константы и растворимость в различных растворителях. Они дают ориентировочную характеристику испытуемого вещества.

Физические свойства твердых веществ оценивают по форме кристаллов или по виду аморфного вещества, его устойчивости к свету, кислороду, содержащемуся в воздухе, гигроскопичности и степени выветривания, запаху, цвету, степени белизны. Степень белизны (по ГФ XI) лекарственного вещества оценивают на спектрофотометрах СФ-18 по спектру отражения образца при его освещении белым светом. Для жидкостей устанавливают цвет, запах, летучесть, подвижность, воспламеняемость [4,5,19] .

Температура плавления — это температура, при которой вещество переходит из твердого состояния в жидкое. По ГФ XI под температурой плавления понимают интервал температур между началом плавления (появление первой капли жидкости) и концом плавления (полным переходом вещества в жидкое состояние). Интервал между началом и концом плавления не должен превышать 2°С. Температура плавления — постоянная характеристика для индивидуального лекарственного вещества. В присутствии даже небольшого количества примесей она изменяется, что используется для подтверждения степени чистоты лекарственных веществ.

Растворимость — свойство газообразных, жидких и твердых веществ переходить в растворенное состояние. Растворимость в фармакопейном анализе рассматривают, как свойство ЛВ растворяться в различных растворителях. Растворимость при постоянной температуре является одной из основных характеристик, с помощью которой подтверждают доброкачественность большинства лекарственных веществ [5].

Для обозначения растворимости в ГФ XI приняты условные термины, указывающие количество растворителя (мл), необходимое для растворения 1 г лекарственного вещества. Различают очень легко растворимые (до 1 мл), легко растворимые (от 1 до 10), растворимые (от 10 до 30), умеренно растворимые (от 30 до 100), мало растворимые (от 100 до 1000), очень мало растворимые (от 1000 до 10 000), практически нерастворимые (более 10 000 мл).

Методика определения растворимости по ГФ XI  состоит в том, что навеска вещества вносится в отмеренный объем растворителя и непрерывно перемешивается в случае необходимости до 10 мин. при 20 ± 2°С. Растворившимся ЛВ считают в том случае, если в растворе при наблюдении в проходящем свете не наблюдается частиц вещества. Отклонения от этого общего правила: образование мутных растворов, растворение более продолжительное, чем в течение 10 минут такие лекарственные вещества называют медленно растворимыми). Показатели растворимости в различных растворителях указываются в ФС. В качестве растворителей, кроме воды, используются растворы кислот и щелочей (карбонатов), а также различные органические растворители (этанол, метанол, хлороформ, эфир, ацетон, гексан, дихлорэтан, этилацетат) и масла [6,7] .

Метод фазовой растворимости основан на правиле фаз Гиббса, которое устанавливает зависимость между числом фаз и числом компонентов в условиях равновесия. Суть установления фазовой растворимости состоит в последовательном прибавлении увеличивающейся массы ЛВ к постоянному объему растворителя при постоянной температуре и непрерывном встряхивании. Затем с помощью диаграмм количественно определяют массу растворенного лекарственного вещества, устанавливая процентное содержание в нем примеси. Таким образом, метод фазовой растворимости позволяет осуществить количественную оценку степени чистоты ЛВ путем точных измерений значений растворимости. Он применим ко всем соединениям, которые образуют истинные растворы, и используется для изучения стабильности и получения очищенных (до 99,5%) образцов лекарственных средств [5] .

1.1.4 Общие требования к испытаниям на чистоту

Основное требование к испытаниям на чистоту — достаточная чувствительность, специфичность и воспроизводимость используемой реакции.

Содержание примесей можно установить эталонным и безэталонным путем. Эталонный — основан на сравнении со стандартом (эталонным раствором), содержащим определенное количество открываемой примеси. При этом в одинаковых условиях выполнения реакции наблюдают окраску или помутнение, возникающие при добавлении соответствующего реактива. Безэталонный путь — установление предела содержания примеси по отсутствию положительной реакции. При этом предел содержания примесей не превышает чувствительности реакции.

Прозрачность и степень мутности. Прозрачными считают растворы, при освещении которых шаровой электролампой (40 Вт) на черном фоне не наблюдается присутствие нерастворенных частиц. Степень мутности устанавливают путем сравнения в одинаковых пробирках растворов испытуемого вещества с растворителем или с эталонами. Эталонами служат взвеси в воде, полученные смешиванием определенных количеств 1% раствора гидразина сульфата и 10% раствора гекса- метилентетрамина.

Окраску жидкостей по ГФ XI устанавливают, сравнивая испытуемые растворы с равным количеством одного из семи эталонов при дневном освещении на матово-белом фоне. Эталоны готовят, смешивая в различных соотношениях четыре основных раствора, получаемых из исходных растворов хлорида кобальта, дихромата калия, сульфата меди (И) и хлорида железа (III). Растворителем служит раствор серной кислоты (0,1 моль/л). Бесцветными считают растворы, цвет которых не отличается от воды.

Адсорбционную способность и дисперсность устанавливают в соответствии с требованиями ФС (ФСП), Дисперсность можно установить по скорости осаждения водной суспензии испытуемого ЛВ в мерном цилиндре. Адсорбционную способность — по обесцвечиванию окраски индикатора (метиленового синего) в растворе ЛВ с определенной концентрацией и в определенном объеме.

Примесь органических веществ обнаруживают действием концентрированной серной кислоты. При этом образуются окрашенные продукты, интенсивность окраски которых не должна превышать соответствующий эталон цветности.

Примесь восстанавливающих веществ устанавливают по обесцвечиванию растворов перманганата калия (определенного объема и концентрации).

Примесь окрашенных веществ определяют по бесцветности водного извлечения. Обнаруживают также примесь водорастворимых солей, нерастворимых в воде, и примеси, нерастворимые в воде, в водорастворимых (по эталону мутности) [6,7] .

1.2 Физические и физико-химические методы исследования

1.2.1 Оптические методы

Рефрактометрия основана на наличии зависимости величины показателя преломления света от концентрации раствора испытуемого вещества. Показатель преломления зависит также от температуры, длины волны света, концентрации вещества и природы растворителя. Рефрактометрию используют для установления подлинности лекарственных веществ по молярной рефракции. Для количественного определения выбирают интервал линейной зависимости между концентрацией раствора и коэффициентом преломления [27] .

1.2.2 Методы, основанные на поглощении электромагнитного излучения

Используют спектрофотометрические методы анализа по поглощению веществами монохроматического электромагнитного излучения (в УФ- и ИК-области) и фотоколориметрические (колориметрические) методы анализа по поглощению веществами немонохроматического излучения.

Фотометрические методы анализа основаны на использовании объединенного закона Бугера-Ламберта-Бера:

где

Jо — интенсивность излучения, падающего на вещество;

J— интенсивность излучения, прошедшего через вещество;

А — величина оптической плотности;

х — показатель поглощения данного вещества;

С — концентрация раствора анализируемого вещества, г/моль;

 I — длина рабочего слоя кюветы, см.

На основании этого закона содержание вещества в растворе определяют по формуле:

В случае несоответствия закону Бугера-Ламберта-Бера вначале с помощью стандартного раствора устанавливают зависимость оптической плотности от концентрации, а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты.

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях — один из наиболее широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе [13]  .

Анализируемые лекарственные вещества должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обусловливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.

Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны  называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в ультрафиолетовой (190-380 нм) и видимой (380-780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

Фотоколориметрия отличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение. Вначале получают окрашенные растворы, используя растворы стандартных образцов. Измерение оптической плотности производят на фотоколориметрах. Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощения окрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание J в испытуемых образцах лекарственного вещества или лекарственной формы [13] .

Метод дифференциальной спектрофотометрии и фотоколориметрии основан на измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество стандартного образца испытуемого вещества или его заменителя. Такой прием приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной погрешности определения до ±0,5-1%, т.е. сопоставимой с титриметрическими методами.

Производная УФ-спектрофотометрия является одним из вариантов дифференциальной спектрофотометрии. Если в дифференциальной спектрофотометрии используют разность оптических плотностей при одной и той же длине волны, то в производной — при двух длинах волн, разделенных небольшим интервалом. Этот вариант основан на выделении индивидуальных полос из УФ-спектра, который представляет собой сумму налагающихся полос поглощения или полос, не имеющих четко выраженного максимума. При этом на спектральных кривых в координатах производная-длина волны появляются полосы с отчетливо выраженными максимумами и минимумами. Благодаря этому можно идентифицировать сходные по химической структуре вещества, повысить избирательность анализа и выполнять количественное определение двух-, трехкомпонентных смесей более экономично и эффективно, чем титриметрическими методами [38] .

1.2.2.1 ИК спектроскопия

ИК спектроскопия основана на явлении поглощения химическими веществами инфракрасного излучения с одновременным возбуждением колебаний молекул. Инфракрасное излучение представляет собой электромагнитную волну и характеризуется длиной волны λ, частотой ν и волновым числом  , которые связаны следующей зависимостью (формула 3) [8]6:

где  с — скорость света

        n — показатель преломления среды.

В спектроскопии поглощения, частным случаем которой является ИК спектроскопия, происходит поглощение молекулами фотонов определённой энергии, которая связана с частотой электромагнитной волны через постоянную Планка (формула 4)

При поглощении фотона происходит возбуждение — увеличение энергии молекулы: она переходит из основного колебательного состояния E1 в некоторое возбуждённое колебательное состояние E2 так, что энергетическая разница между этими уровнями равна энергии фотона (формула 5)

Рисунок 1 – Поглощение  электромагнитного излучения

Энергия поглощённого инфракрасного излучения расходуется на возбуждение колебательных переходов для веществ в конденсированном состоянии. Для газов поглощение кванта ИК - излучения приводит к колебательным и вращательным переходам [8].

ИК- область охватывает длины волн от 103 до 106 нм, что соответствует энергии кантов от 3 до 60 кДж / моль.  

ИК – спектр представляют в виде зависимости пропускания Т, в процентах от волнового числа или длины волны (формула 4)

T =(I/I0)•100% ,

где  Т – процент пропускания проходящего света;

I – интенсивность проходящего через вещество излучения, Вт/м2;

I0 – интенсивность падающего на вещество излучения, Вт/м2.

Пропускание связано с оптической плотностью соотношением          

   D = lgT-1  и измеряется в процентах от интенсивности падающего света.

Различаю два вида колебаний в молекулах – валентные и деформационные. Валентные колебания изменяют длину связи между атомами (растягивание – сокращение) и обозначаются ν. В свою очередь эти колебания подразделяются на симметричные, происходит одновременное растяжение и сжатие связей, и ассиметричные, изменение длины связи происходит поочередно. Колебания обозначаются соответственно νs и νas [9] .

Деформационные колебания обусловлены изменением валентных углов и обозначаются δ. Виды деформационных колебаний представлены в    таблице 1.

Таблица 1 – Виды деформационных колебаний

Деформационные колебания

Плоскостные Внеплоскостные

Ножничные Маятниковые Веерные Крутильные

+          +

+         -

Для заключений  о составе и строении вещества по его инфракрасному спектру приходится использовать эмпирические и полуэмпирические закономерности и в первую очередь характеристичность нормальных колебаний. У ряда соединений со сходными элементами структуры частоты некоторых нормальных колебаний близки. Соответствующие таким нормальным колебаниям полосы поглощения в спектрах называются характеристическими полосами, а частоты их максимумов поглощения – их характеристическими частотами. Структурный анализ по инфракрасным спектрам сводится в настоящее время к отысканию характеристических полос поглощения и их отнесению к соответствующим структурным элементам с учетом численных значений частот максимумов поглощения, контура и интенсивности полос [9].

Наиболее ванные и надежно интерпретируемые характеристические полосы поглощения располагаются в коротковолновой (высокочастотной) области частот основных колебаний молекул от 2,5 до 7 мкм ( ν от 4000 до 1500 см-1) (см. рисунок 2).

Рисунок 2 – ИК спектр органического вещества, записанный на современном двухлучевом спектрофотометре [9].

Длинноволновая часть спектра с  λ > 7 мкм обычно гораздо более сложна и содержит наряду с характеристическими полосами большое число интенсивных полос поглощения, контур и положение которых индивидуальны для каждой сложной молекулы.  Поэтому длинноволновая часть ИК спектра исключительно важна для идентификации органических препаратов, а участок спектра с λ > 7 мкм получил название « область отпечатков пальцев». Эта область используется в структурном анализе для подтверждения отнесения характеристических высокочастотных полос и для обнаружения некоторых группировок большой массы [10].

1.2.2.2 Приборы, применяемые в ИК спектроскопии

Термин "ИК-Фурье спектроскопия" возник с появлением нового поколения приборов, в основе оптической схемы которых используются различного типа интерферометры. ИК-Фурье спектроскопия представляет собой один из вариантов метода ИК спектроскопии и по существу не является отдельным спектральным методом. Спектры веществ, полученные на ИК-Фурье спектрометрах, не отличаются от спектров, полученных на диспергирующих ИК спектрометрах [9].

Спектры с помощью Фурье-спектрометров получают в два этапа. Сначала регистрируется интерферограмма т.е. выходной световой поток в зависимости от разности хода разделенной на когерентные пучки входной волны от источника. Затем путём обратного преобразования Фурье (по разности хода) вычисляется спектр. Вторая часть требует относительно большого объема вычислений, поэтому метод получил широкое распространение только с появлением современных компьютеров.