V006442 Дипломная работа Влияние кверцетина на состав гликополимеров поверхности Azospirillum lipoferum Sp59b

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1 Общие сведения о флавоноидах и их классификация 7

1.2 Функции и практическое применение флавоноидов 12

1.2.1 Роль флавоноидов в растительно-микробных взаимодействиях 14

1.2.2 Влияние флавоноидов на полисахаридный состав поверхности 16

бактериальной клетки 16

1.3 Бактерии рода Azospirillum как модельный объект исследования ассоциативных симбиозов 18

1.3.1 Гликополимеры поверхности азоспирилл, участвующие в формировании ассоциации с растениями 19

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23

2.1 Приборы и материалы 23

2.2 Объект исследования 24

2.3 Методы исследования 24

2.3.1 Условия культивирования микроорганизмов 24

2.3.2 Проверка чистоты культуры 26

2.3.3 Определение бактериостатической активности 26

2.3.4 Экстракция ЛПС для анализа методом электрофореза 26

2.3.5 Выделение препарата ЛПС 27

2.3.6 Хроматографические методы 28

2.3.6.1 Гель-фильтрация 28

2.3.6.2 Тонкослойная хроматография 28

2.3.7 Колориметрические методы 29

2.3.7.1 Определение содержания углеводов в ЛПС 29

2.3.7.2 Определение концентрации белков по методике Бредфорд 29

2.3.7.3 Определение 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты 30

2.3.7.4 Определение общего фосфора по методу Беренблюм и Чейн 30

2.3.7.5 Исследование состава жирных кислот липидов А ЛПС 31

3.1 Определение минимальной концентрации флавоноидов, индуцирующей изменения в ЛПС 33

3.2 Выделение ЛПС из внешней мембраны бактерий A. lipoferum Sp59b 37

3.3 Анализ химического состава ЛПС А. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии 0.4 мг/мл кверцетина 40

3.3.1 Анализ биополимерного состава ЛПС 40

3.3.2 Анализы химического состава липидных и углеводных компонентов комплекса 43

ВЫВОДЫ 45

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 46

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОА  -  антиоксидантная активность

ГЖХ  -  газожидкостная хроматография

ДМФА  -  диметилформамид

ДМСО  -  диметилсульфоксид

КДО  -  2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота

КПС  -  капсульный полисахарид

ЛПБК  -  липополисахарид-белковый комплекс

ЛПС  -  липополисахарид

ОПС  -  О-специфический полисахарид

ПС  -  полисахарид

ПСЛК  -  полисахарид-липидный комплекс

ТСХ  -  тонкослойная хроматография

УФ  -  ультрафиолетовый

ЭДТА  -  этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПС  -  экзополисахарид

Nod-  -  nodulation (клубенькообразование)

ВВЕДЕНИЕ

Симбиоз (греч. symbiosis – совместная жизнь) – одна из основных стратегий эволюции и поддержания жизни на Земле. В формировании растительно-микробных систем важную роль играют метаболиты партнеров симбиоза и регуляторы роста растений, используемые в современных агротехнологиях. Большой интерес представляет выяснение участия в этих процессах веществ фенольной природы – флавоноидов, которые экскретируются корнями растения и участвуют в формировании его бактериального окружения, оказывая влияние на развитие почвенных микроорганизмов.

Известно, что флавоноиды играют заметную роль в различных микробно-растительных взаимодействиях: активизируют транскрипцию nod-генов и, как следствие, индуцируют синтез сигнальных молекул – Nod-факторов – у бактерий рода Rhizobium; играют важную роль в индукции гена GmGin1 грибов при образовании арбускулярно-микоризальных симбиозов; вызывают экспрессию vir-гена у фитопатогенов рода Agrobacterium (Mandal et al., 2010). Для бактерий рода Sinorhizobium установлено инициированное флавоноидами изменение качественного и количественного состава гликополимеров поверхности, а именно экзополисахаридов (ЭПС), капсульных полисахаридов (КПС) и липополисахаридов (ЛПС) (Fraysse et al., 2002), которые принимают непосредственное участие в коммуникации микробов с микро- и макроокружением. Влияние флавоновых веществ на состав углеводных компонентов клеточной мембраны ассоциативных микроорганизмов, модельным объектом изучения которых являются бактерии рода Azospirillum, не изучено. Поскольку установлено участие КПС и ЛПС во взаимодействии азоспирилл с растениями, решение данного вопроса является важным для понимания молекулярных механизмов формирования растительно-микробных ассоциаций. Учитывая, что наибольший практический интерес представляет успешность формирования ассоциации азоспирилл с хлебными злаками, в частности с пшеницей, а одним из основных широко распространённых флавоноидов этого растения является кверцетин (Winkel-Shirley, 2001; Calzuola et al., 2004; Matus et al., 2008), именно этот метаболит и был использован нами в модельном эксперименте с типовым штаммом вида A. lipoferum Sp59b.

Исходя из вышесказанного, цель работы состояла в выявлении характера влияния флавоноида кверцетина на структурные особенности липидных и углеводных компонентов ЛПС бактерий A. lipoferum Sp59b.

Для достижения данной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Определение минимальной бактериостатической концентрации кверцетина по отношению к A. lipoferum Sp59b.

2. Определение минимальной концентрации кверцетина, в которой он оказывает влияние на состав ЛПС A. lipoferum Sp59b.

3. Анализ электрофоретического профиля ЛПС бактерий A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина.

4. Исследование влияния выращивания A. lipoferum Sp59b в присутствии кверцетина на биополимерный состав, соотношение жирных кислот и моносахаридов, образующих ЛПС бактерий.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие сведения о флавоноидах и их классификация

Флавоноиды – группа гетероциклических природных фенольных соединений, содержащихся в высших растениях. Большая часть из них принадлежит к производным флавана (катехины, лейкоантоцианы), флавона (флавонолы, флаванонолы, флавоны, флавононы) и флавилия (антоцианы, 3-дезоксиантоцианы). Большинство природных флавоновых соединений – О-, реже С-гликозиды с одной или несколькими гидроксильными или метоксильными группами, находящимися преимущественно в положениях 5, 7, 4’, 3’, 5’, чем объясняется многообразие данных соединений (Andersen and Markham, 2006). Исключение составляют флавоны, среди которых гликозиды встречаются редко. Углеводная часть молекул флавоноидов обычно содержит остатки глюкозы, рамнозы, галактозы, арабинозы, ди- или трисахаридов (Запрометов, 1993).

Термином «флавоноид» обозначают широкий спектр веществ, имеющих в своем составе C6-C3-C6 углеродный скелет или более специфичную фенилбензопирановую функциональную группу (Grotewold, 2006). Существует несколько классификаций флавоноидов. По классификации Запрометова, основанной на различии в степени окисления центрального трехуглеродного фрагмента C2, C3 C4, различают производные флавана, флаван-3-ола, флаван-3,4-диола, 3-гидрокси-2-фенилхромелийхлорида (антоцианы), флаванона, флаванонола, флавонола, изофлавона (Запрометов, 1993).

По Гроутволд (Grotewold, 2006), в зависимости от места прикрепления ароматического кольца к бензопирановой (хромановой) части, все флавоноиды разделяют на 3 класса:

1. флавоноиды (2-фенилбензопираны);

2. изофлавоноиды (3-бензопираны);

3. неофлавоноиды (4-бензопираны).

Все эти группы имеют халконового предшественника и поэтому биогенетически и структурно связаны.

На основании степени окисления и насыщенности в гетероциклическом C-кольце 2-фенилбензопираны (флавоноиды) могут быть разделены на группы, формулы которых отражены на рисунке 1:

1. флаваны;

2. флавононы;

3. флавоны;

4. флавонолы;

5. дигидрофлавонолы;

6. флаван-3-олы;

7. флаван-4-олы;

8. флаван-3,4-диолы.

Изофлавоноиды – второй класс флавоновых веществ. В их структуру входит 3-фенилхромановый скелет, биогенетически полученный миграцией 1,2-арила в 2-фенилхромановом предшественнике. Несмотря на сравнительно небольшое распространение в царстве растений, изофлавоноиды очень разнообразны (Grotewold, 2006; Andersen and Markham, 2006). Причина этого заключается не только в количестве и сложности основного 3-фенилхроманового скелета, но также в различии степеней окисления и присутствии дополнительных гетероциклических колец. Изофлавоноиды делятся на следующие группы (рисунок 2):

1. изофлаван;

2. изофлавон;

3. изофлавонон;

4. изофлав-3-ен;

5. изофлавонол;

6. ротеноид;

7. кумистан;

1.Флаван  

2.Флавонон  

3.Флавон

4.Флавонол  

5.Дигидрофлавонолы  

6.Флаван-3-олы

7.Флаван-4-ол  

8.Флаван-3,4-диол

Рисунок 1. Структурные формулы молекул, относящихся к классу флавоноидов.

1.Изофлаван  

Изофлавон  

3.Изофлавонон

4.Изофлаван-3-ен  

5.Изофлавонол  

6.Ротеноид

7.Кумистан  

8.3-Арилокумарин  

9.Кумаронхромен

10.Кумаронхромон  

11.Птерокарпан

Рисунок 2. Структурные формулы молекул, относящихся к классу изофлавоноидов.

8. 3-арилкумарин

9. кумаронхромен;

10. кумаронхромон;

11.  птерокарпан.

Неофлавоноиды биогенетически и структурно близки к флавоноидам и изофлавоноидам и представлены 4-арилкумаринами (4-арил-2H-1-бензопропан-2-оны), 3,4-дигидро-4-арилокумаринами и неофлавенами (рис. 3).

1.4-арилокумарин  

2.3,4-дигидро-4-арилокумарин

3. Неофлавен

Рисунок 3. Структурные формулы молекул, относящихся к классу неофлавоноидов.

Природные вещества, такие как халконы и ауроны также имеют C6-C3-C6 углеродный скелет и считаются минорными флавоноидами. Они включают 2’-гидрохалконы, 2’-ОН-дигидрохалконы, 2’-ОН-ретро-халконы, ауроны (2-бензолиденкумарононы) и ауронолы (Grotewold, 2006).

1.2 Функции и практическое применение флавоноидов

Флавоноиды – особая группа растительных веществ. Ни один другой класс вторичных метаболитов не обладает такими разнообразными функциями: от привлечения насекомых для опыления и распространения семян до хемоаттракции и стимуляции азотфиксации бактерий рода Rhizobium (Andersen and Markham, 2006).

Флавоновые вещества играют важную роль в размножении растений. Поскольку пигментация является фактором привлечения, растения, опыляемые насекомыми и птицами, обычно имеют крупные цветки с ярко окрашенными лепестками. Окрашивание обеспечивается таким флавоноидом, как нарциссин, что показано для календулы лекарственной (Calendula officinalis L.) (Andersen and Markham, 2006; Шарова и Куркин, 2006).

Некоторые флавоноиды окрашивают лепестки цветка в желтый и красный цвета. Этот факт выявлен для красноцветковых видов лилий (Lilium L.) (Andersen and Markham, 2006; Дейнека с соавт., 2008). Желтое окрашивание достигается метилированием или некоторыми видами гликозилирования флавонолов. Также желтый цвет может обеспечиваться агрегацией неокрашенных гликозидов флавоноидов в цитоплазме эпидермальных клеток. Антоцианидины, флавонолы и халконы могут быть сосредоточены также в гранулах пыльцы. Привлечение насекомых обеспечивается благодаря ультрафиолетовому (УФ) излучению, отраженному или поглощенному (Andersen and Markham, 2006).

Содержание флавоноидов в растении зависит от этапа онтогенеза, состояния почвы. В репродуктивных органах наибольшее количество фенольных соединений наблюдается в бутонах в начале цветения. Для ортилии однобокой (Ortilia secunda L. house) обнаружена положительная зависимость количества флавоновых веществ в растении от содержания фосфора в почве (Andersen and Markham, 2006; Ломбоева с соавт., 2008). Если почва бедна азотистыми соединениями, уровень флавоноидов в корнях резко увеличивается, что, очевидно, является приспособительной реакцией для привлечения ассоциативных азотфиксирующих бактерий (Andersen and Markham, 2006; Kong et al., 2003). Немаловажно, что флавоноиды способны защищать растения от опасных микроорганизмов, являясь в то же время аттрактантами для ризобактерий (Grotewold, 2006).

Антоцианидины – хорошие защитники растений от УФ излучения. Их спектр поглощения находится между 270 и 290 нм, а ацилированные антоцианидины имеют гораздо более широкий спектр. Если поглощенная энергия ультрафиолета не транспортируется клеточным органеллам, то антоцианидины способны уменьшить вред, наносимый ДНК, белкам и мембранам растений, произрастающих в областях с высокой долей УФ излучения (Andersen and Markham, 2006).

Флавоноиды, наряду с другими веществами, также играют важную роль в защите растения от тяжелых металлов. Было показано, что при выращивании кукурузы в почве с повышенным содержанием алюминия интенсифицировалась экскреция экссудата, в котором возрастало количество флавоновых веществ. Кроме того, обнаружена способность флавоновых веществ к формированию комплексов с тяжёлыми металлами внутри корней растений (Запрометов, 1993; Andersen and Markham, 2006).

Большой интерес исследователей к данной группе соединений обусловлен тем, что ряд флавоноидов проявляет антивирусные, антиаллергенные, антибактериальные, противоопухолевые, антимутагенные и антиоксидантные свойства (Запрометов, 1993; Мустафаев с соавт., 2005; Поспелова с соавт., 2005).

Известно, что синтетические препараты флавоноидов, такие как кверцетин, дигидрокверцетин, галангин и другие, обладают антиоксидантной активностью (АОА) и, соответственно, являются антимутагенами. Однако при определенных условиях эти же соединения могут выступать в роли индукторов свободных радикалов кислорода и в связи с этим проявлять мутагенную активность в клетках различных видов, включая клетки эукариот. При изучении свойств синтетических препаратов флавоноидов (на примере кверцетина) обнаружено, что по АОА они значительно уступают естественным источникам флавоноидов (Мустафаев с соавт., 2005; Поспелова с соавт., 2005). Так, антоцианы защищают клетку от активных форм кислорода и азота в 4 раза лучше, чем α-токоферол и аскорбиновая кислота, а в системе ферментативного перекисного окисления липидов флавоноиды проявляют АОА, превосходя стандартно применяемый в клиниках антиоксидант α-токоферол, но уступая унитиолу. Обнаружена способность флавоноидов тормозить окисление адреналина (Мустафаев с соавт., 2005).

1.2.1 Роль флавоноидов в растительно-микробных взаимодействиях

В формировании растительно-микробных систем важную роль играют метаболиты партнеров симбиоза и регуляторы роста растений. Флавоноиды являются инициаторами молекулярного диалога между растением и ризобиями. Они выступают в качестве хемоаттрактантов и стимулируют таксис бактерий к растениям (Овцына и Тихонович, 2004). Например, нарингенин в концентрации 1×10-5 и 5×10-5 M значительно увеличивает колонизацию корней риса бактериями Azorhizobium caulinodans и привлекает A. brasilense (Jain and Gupta, 2003).

Флавоноиды также препятствуют процессу инфицирования растений (флавоны, катехины). И лишь небольшими изменениями в составе могут обусловливать их функцию – антибактериальная защита, либо обеспечение растительно-микробного взаимодействия.

Флавоноиды участвуют как во внутриорганизменной передаче сигналов, так и выступают в роли эффекторов процесса нодуляции. Они активируют nod-гены и способны влиять на развитие почвенных микроорганизмов (Grotewold, 2006). Большинство работ, посвященных изучению влияния флавоноидов на микроорганизмы, в настоящее время сосредоточено в рамках формирования бобово-ризобиальных симбиозов, которые характеризуются формированием клубеньков, где бактерии переходят в эндосимбиотическую форму – бактероиды – и преобразуют атмосферный азот в ионы аммония (Andersen and Markham, 2006; Wasson et al., 2003).

Некоторые ризобии невидоспецифичны, однако для большинства бактерий этого рода характерна строгая приуроченность к колонизации определенного растения-хозяина. Причиной этого, очевидно, является действие продуцируемых корнями растения флавоноидов, которые стимулируют процесс образования клубеньков, способствуют заселению растений специфичными видами ризобий и ингибируют взаимодействие с остальной микрофлорой почвы (Запрометов, 1993).

Первые флавоноиды, вызывающие экспрессию nod-генов – лютеолин, выделяемый растением Medicago sativa, и 7,4-дигидроксилфлавон из Trifolium repens, – открыты в 1986 году (Peters et al., 1986). В настоящее время известно четыре класса флавоноидов (флавоны, флавонолы, флавононы и изофлавоны), которые способны индуцировать транскрипцию nod-генов бактерий рода Rhizobium (Denarie et al., 1992).

Специфические флавоноиды, присутствующие в экссудатах корней потенциальных растений-хозяев, узнаются регуляторами экспрессии nod-генов, в частности, белком NodD, который локализован в мембране бактериальной клетки. Комплекс NodD-флавоноид активирует транскрипцию ряда «симбиотических» генов бактерии (nod, nol, noe), в результате чего осуществляется синтез и выделение N-ацетилхитиноолигосахаридов – Nod-факторов (Овцына и Тихонович, 2004). К веществам, активирующим nod-ген и выделенным из семян бобовых растений, относят флавоны, флавононы, флавонолы, изофлавоны и антоцианидины (Andersen and Markham, 2006). Белок NodD каждого конкретного вида ризобий вызывает индукцию генов только в сочетании с определенными специфическими флавоноидными индукторами. Например, лютеолин и кверцетин, содержащиеся в экссудатах люцерны, пажитника и донника взаимодействуют с белком NodD и индуцируют экспрессию nod-генов бактерий S. meliloti (Овцына и Тихонович, 2004).

Секретируемые Nod-факторы изменяют pH апопласта и инициируют кальциевый поток, который, как считают, индуцирует или подавляет защиту растения. Образование клубеньков начинается, когда бактерия проникает в корень и заканчивается формированием васкулярного узелка в капе. На ранних стадиях процесса нодуляции флавоноиды регулируют транспорт гормона роста (ауксина) к кончику корня и его концентрацию внутри клубенька (Wasson et al., 2006).

Действие флавоноидов очень специфично. Исследования показали, что в экссудатах проростков гороха содержится 450 нмоль агликоновых флавонолов (мирецетин, кверцетин, кемпферол) и 2.5 нмоль агликоновых антоцианидов (эльфинидин, петунидин, мальвидин). Тем не менее, экспрессию nod-гена вызывает лишь нарингенин, тогда как кверцетин ингибирует взаимодействие бактерий R. leguminosarum с корнями гороха. Лютеолин стимулирует нодуляцию люцерны при проникновении бактерий S. meliloti, гинестеин и дайдзеин специфичны для пары соя–Bradyrhizobium japonicum, а 7,4’-дигидроксифлавон – для R. leguminosarum и клевера (Groutwold, 2006).

Некоторые флавоноиды при инфицировании растений ризобиями воздействуют на рост бактерий и изменяют их метаболизм (Andersen and Markham, 2006).

1.2.2 Влияние флавоноидов на полисахаридный состав поверхности

бактериальной клетки

Полисахариды (ПС) поверхности бактериальной клетки (ЭПС, КПС, ЛПС и циклические глюканы) играют важную роль в растительно-микробных взаимодействиях (Fraysse et al., 2002). Для индукции синтеза ПС, в отличие от Nod-факторов, присутствие флавоноидов не является обязательным условием.