W003559 Дипломная работа Получение каллусных тканей nicotiana tabacum l. и их цитологическая характеристика

АННОТАЦИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений и биотехнологий факультета биологии и химии Таврической  академии (структурного подразделения) Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского, в период с 2016 по 2017 год.

Выпускная квалификационная работа направлена на изучение особенностей процесса каллусообразования в культуре вегетативных органов N. tabacum на питательных средах Мурасиге и Скуга in vitro. Установлено, что на безгормональной питательной среде индукция каллусообразования в культуре вегетативных органов не наблюдается, при этом максимальный показатель частоты каллусообразования наблюдался на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 0,5 мг/л кинетина, 0,5 мг/л БАП, 2,0 мг/л 2,4-Д. Цитологические исследования позволили установить, что каллусные культуры N. tabacum L., состояли преимущественно из клеток паренхимного типа различной формы. Большую часть составляли клетки округлой формы. Также среди каллусных клеток встречались трахеидоподобные элементы. При выполнении работы использовались следующие методы исследования: наблюдение за процессами роста и развития растений, культура изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, цитологические методы, морфометрические методы и математическая обработка результатов эксперимента.

Объем материала: дипломная работа представлена на 58 страниц и состоит из введения, 4 разделов, выводов, списка использованной литературы (54 источников), содержит 6 таблиц и 18 рисунков.

Ключевые слова: Nicotiana tabacum L., листовые экспланты, каллусная культура, in vitro.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

6-БАП – 6-бензиламинопурин

2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусноя кислота

IL – интерлейкин

MC – состав базовой среды по Murashige, Skoog (1962)

IgA – иммуноглобулин

IgG – иммуноглобулин

HbsAg – маркер вирусного гепатита В

ВТМ – вирус табачной мозаики

СОДЕРЖАНИЕ

      стр.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3

ВВЕДЕНИЕ 5

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 8

1.1. Ботаническая характеристика и биологические особенности семейства Паслёновые (Solanaceae) 8

1.2. Ботаническая характеристика рода Табак (N. tabacum) 13

1.3. Практическое использование рода Табак 16

1.4. Культивирование и распространение табака в мире 18

1.5. Особенности культивирования табака в условиях Крыма 19

1.6. Современные методы создания промышленных сортов табака 23

1.6.1. Применение генетической инженерии в селекции табака 25

1.6.2. Клеточная инженерия растений в селекции табака 30

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32

РАЗДЕЛ 3. ОХРАНА ТРУДА 36

РАЗДЕЛ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 41

4.1. Изучение особенностей каллусогенеза в культуре вегетативных органов табака in vitro 41

4.2. Получение асептических культур 41

4.3. Зависимость частоты каллусообразования от состава питательной среды. 43

4.4. Цитологические особенности каллусных культур табака 48

ВЫВОДЫ 53

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 54

ВВЕДЕНИЕ

Табак (Nicotiana tabacum) – однолетнее растение из семейства паслёновые (Solanaceae). В промышленности культивируют из-за листьев, представляющих хозяйственно ценную часть растения.

Табак (N. tabacum) относят к числу засухоустойчивых растений, однако максимальный урожай получают в условиях хорошего водоснабжения. Недостаточная обеспеченность водой ведет к торможению ростовых процессов, удлинению фаз роста, уменьшению размеров листьев, к увеличению их толщины и плотности. Это приводит к потере хозяйственно- значимых качеств сырья и как следствие, снижению его стоимости и конкурентоспособности.

Известно, что биотехнология растений основана на методах культуры клеток и тканей. Культурой  клеток, тканей и органов растений называется выращивание отдельных клеток, а также тканей и органов на искусственной питательной среде в асептических условиях. Этот метод лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Культура клеток высших растений может рассматриваться с трех точек зрения – как уникальная биологическая система, как модель в физиологии, биохимии и генетике растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологии. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности, благодаря которым культура клеток и тканей растений представляет новую экспериментально созданную биологическую систему.

Отличия культивируемых клеток от клеток организма, специально усиленные путем создания биохимических мутантов, гибридных или  трансформированных клеток,  помогают  глубже  проникнуть в механизмы  процессов, происходящих в растении. В качестве биологической модели клетки in vitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений, а также генетиков. Однако степень адекватности такой модели зависит от изучаемого процесса. Культура клеток, как правило, является адекватной моделью для тех процессов, которые протекают в любой растительной клетке, независимо от существующих систем контроля. Для тех клеточных функций, где принципиальную роль играют механизмы организменного контроля развития, модель может быть неадекватной. Культура клеток растений широко используется в самых разнообразных фундаментальных и прикладных исследованиях. На основе культивируемых клеток и тканей высших растений в настоящее время созданы и активно развиваются перспективные, принципиально новые технологии для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства. В этой связи актуальным является разработка способа получения каллусных культур на основе культивирования листовых эксплантов табака.

Перспективным подходом, позволяющим существенно повысить адаптационный потенциал растений является использование прямой клеточной селекции на основе культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro. Это позволит обогатить исходный селекционный материал засухоустойчивыми формами, полученными методом клеточной инженерии.

В этой связи, является актуальным изучение возможности получения каллусных культур табака (N. tabacum), имеющих высокие значения ростового индекса для дальнейшего использования в работах по клеточной селекции.

Цель исследования: изучить особенности каллусогенеза в культуре вегетативных органов табака (N. tabacum) in vitro.

Задачи исследования:

1. Отработать условия стерилизации эксплантов N. tabacum перед введением в культуру in vitro.

2. Установить зависимость частоты каллусообразования и ростового индекса каллусных культур N. tabacum от гормонального состава питательных сред.

3. Выявить морфологические и цитологические особенности культивируемых каллусных культур табака.

Предмет исследования: морфогенетические реакции и показатели регенерационной способности in vitro эксплантов вегетативных органов и каллусных культур табака.

Методы исследования: культура изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, визуальные наблюдения, цитологические методы, морфометрические методы и математическая обработка результатов эксперимента.

Апробация результатов исследования: результаты исследования были представлены на II научной конференции профессорско-преподавательского состава, аспирантов, студентов и молодых ученых Дни науки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского (Симферополь, 2016).

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Ботаническая характеристика и биологические особенности семейства Паслёновые (Solanaceae)

Родиной семейства является Южная Америка. Паслёновые (Solanaceae) включает около 90 родов и 2500 видов, которые распространены в областях с тропическим, субтропическим и умеренным климатом. Представлены кустарниками, травами, лианами, реже деревьями с очередными цельными или рассеченными листьями, без прилистников. Цветки обоеполые, правильные, редко слегка зигоморфные, в цимозных, тирсоидных соцветиях или монохазиях, иногда одиночные. Околоцветник 5 -членный. Чашечка сростнолистная, обычно глубокораздельная, остающаяся и часто при плодах увеличивающаяся. Венчик сростнолепестный с короткой или длинной трубкой и 5 – лопастным колесовидным или воронковидным отгибом. Тычинок 5 или меньше (тогда 1 – 3 превращены в стаминодии). Тычиночные нити обычно короткие, прикрепленные к трубке венчика. Пыльники крупные, часто сближенные в центре цветка, иногда неравные. Завязь верхняя, из 2 плодолистиков, расположенных косо по отношению к средней линии цветка 2 – (3 – 5) – гнездная. Семязачатков много, анатропных, с 1 интегументом, развивающихся на толстых плацентах, возникающих из перегородок или (если завязь 5 –  гнездная) центральных углов завязи. Столбик с  2 –  раздельным или 2 – лопастным рыльцем.  Плод – ягода или коробочка. Семена с эндоспермом. Очень характерно срастание осей с черешками листьев. Сосудистые пучки биколлатеральные [2].

Следует отметить, что многие виды паслёновых высокоспециализированы к опылению. У некоторых видов (например, картофель обыкновенный), тычинки собраны в конус под возвышенным пестиком, большей частью наблюдается самоопыление, но у естественных гибридных видов «горького картофеля»  триплоидного картофеля  Юзепчука и пентаплоидного картофеля короткодольчатого цветки стерильны и размножение происходит вегетативно. Цветки собраны в завиток, или  двойной завиток. Могут быть одиночные.

Также встречаются среди пасленовых и бесстеблевые растения.  Есть эпифиты, лианы с воздушными корнями, например, маркея (Markea). А  среди растений рода хуануллоа (Juanulloa).

 Паслёновые богаты алкалоидами. Также найдены стероидные сапонины, витанолиды, кумарины, флавоноиды, каротиноиды, и   антрахиноны. Тропин, этерифицируясь троповой кислотой, образует алкалоид гиосциамин. Природный гиосциамин – левовращающий. В таком виде он переходит в галеновые препараты, а при выделении в чистом виде получают его инактивный рацемат –  атропин в виде сульфата.

Скопин с троповой кислотой образует алкалоид скополамин. Природный скополамин является левовращающим соединением. Его рацемат называется атросцином. Скополамин получают в виде гидробромида.

Содержание алкалоидов у пасленовых варьирует от 0,04 – 3%. Сумма алкалоидов различна в отдельных органах растений, также наблюдается индивидуальная изменчивость в зависимости от фазы вегетации и условий окружающей среды.

У всех видов семейства Паслёновые в состав суммы алкалоидов входят оба главных алкалоида, но в разных соотношениях.

В растениях этого семейства, а именно в белене, красавке, дурмане,  скополии содержатся алкалоиды. В основе строения которых лежит конденсированная система из пиперидинового и пирролидинового циклов, известная под названием тропана. Все тропановые алкалоиды являются производными двух аминоспиртов: тропина и скопина, которые образуют сложные эфиры с троповой кислотой [52].

Растения семейства пасленовых (Solanaceae) использовались с древних времен. Их корневища, содержащие алкалоиды гиосциамин и мандрагорин, считали одним из сильнейших лекарственных. В современное время растения этого семейства используются также как, розоцветные, бобовые, злаки. В фармацевтической промышленности используются белена черная, дурман обыкновенный, дурман индейский, красавка белладонна, скополия карниолийская. Из этих растений получают тропановые алкалоиды, которые  обладают аналгезирующим, седативным, действием. Перец однолетний используется как местно – раздражающее средство, а картофель обыкновенный как источник крахмала. В пищевой промышленности  наиболее часто выращивают картофель обыкновенный, баклажан, перец однолетний, томат.

 В табачной промышленности используется табак настоящий и табак махорка. Табак махорка является источником лимонной кислоты, никотина, никотинсульфата и никотиновой кислоты. Паслёновые необходимы для получения масел и экстрактов для косметической промышленности [41].

Растения этого семейства довольно характерное и различаемое в природе.  Исключительное хозяйственное значение имеет картофель (Solanum tuberosum), происходящий из западной части Южной Америки. Пищевое значение картофеля в умеренных странах Европы и Америки очень велико. В середине XIX столетия вследствие неурожая картофеля в Ирландии, когда произошло поражение фитофторой это  вызвало массовую эмиграцию в Америку. Клубни картофеля помимо крахмала (14%  –  24% от сырой массы) содержат белки с важными для жизни человека аминокислотами. Однако позеленевшие клубни содержат ядовитый глюкоалкалоид соланин. За годы культуры картофеля возникли тысячи сортов. Большинство современных сортов гибридного происхождения. Многие сорта созданы у нас в специальном научно-исследовательском институте картофельного хозяйства. Ягоды также содержат соланин (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Внешний вид Solanum tuberosum Keng. [Электронный ресурс]. – Режим доступа к статье: http://www.plantarium.ru/page/view/item/36149.html (дата обращения: 20.01.17)

Большое значение имеют томаты, или помидоры (Lycopersicum esculentum), происходящие также из Южной Америки (рис. 1.2).

Томаты – теплолюбивая культура, хорошо развивающаяся при температуре 20 – 25 ºС. При температуре ниже 15 ºС томаты не зацветают. Известно множество сортов томатов, причем плоды некоторых из них достигают 900 г и более. За рубежом наиболее крупные площади под томатами находятся в США.

Известными овощными растениями являются также баклажаны (рис. 1.3) (Solanum melongena) и красный, или стручковый, перец (Capsicum annuum). Баклажаны происходят из Индии, а красный перец – из тропической Америки. Обе культуры достаточно теплолюбивые. Плоды красного перца занимают первое место среди овощей по богатству витаминами А и С.

Рис. 1.2. Внешний вид  Lycopersicum esculentum  Keng. [Электронный ресурс]. –  Режим к статье: http://www.plantarium.ru/page/image/id/503936.html (дата обращения: 20.01.17)

Рис. 1.3. Внешний вид Solanum melongena Keng. [Электронный ресурс]. – Режим доступа к статье:  http://www.plantarium.ru/page/image/id/485378.html (дата обращения 20.01.17)

Ранее упоминалось, что чашечка пасленовых – остающаяся и часто увеличивающаяся при плодах. А у физалиса обыкновенного (Physalis alkekengi) она к тому же ярко – оранжевого цвета. Из – за этого растение часто разводят в садах как декоративное.

Также к пасленовым относят одни из самых важных в экономическом отношении и известных растений, таких как табак (Nicotiana tabacum) и махорку (N. rustica). Для приготовления различных табачных изделий используют высушенные листья растений, содержащие большое количество ядовитого алкалоида – никотина. Наибольшие посевы табака – в Китае, Индии, США, в России –  в Краснодарском крае [25].

1.2. Ботаническая характеристика рода Табак (N. tabacum)

Систематическое положение рода - Nicotiana L.

Отдел - Magnoliophyta

Класс - Magnoliopsida

Порядок - Solanales

Семейство - Solanaceae

Род - Nicotiana

Вид – Nicotiana tabacum  L. [40].

Табак (N. tabacum) – однолетнее растение с прямостоячим стеблем, высота которого может достигать до 1,5 метров. Листья сидячие или с укороченными черешками, овальной или эллиптической формы. Стебли и листья покрыты короткими волосками. Цветки обоеполые, розовой или красной окраски, самоопыляющиеся, но возможно и перекрестное опыление. Соцветия находятся на верхушке стебля и представляют из себя более или менее плотную метелку. Плод ¬– двухгнездная, многосемянная коробочка овальной формы. Семена темно-коричневые, мелкие, масса 1000 штук от 0,05 ¬– 0,25 г. В жизненном цикле табака (N. tabacum) различают 2 периода ¬– до высадки растений в поле (рассадный) и после высадки (полевой). Период формирования рассады заканчивается ко времени появления у растений 5 ¬– 6 настоящих листьев и продолжается 35   –  45 дней. После высадки рассады в поле и укоренения растений, у табака наступает период быстрого роста. Особенно интенсивно растет табак до появления бутонов. Продолжительность периода быстрого роста 30 – 40 дней (рис. 1.4 – 1.6).

Рис. 1.4. Внешний вид Nicotiana tabacum Keng. [Электронный ресурс]. – Режим доступа к статье: http://www.plantarium.ru/page/image/id/268603.html (дата обращения: 20.01.17)

Общий период вегетации от высадки в грунт до цветения составляет 40 ¬– 60 дней. Цветение и созревание семян продолжается 20  –  30 дней. Техническая спелость листьев первого яруса (готовность к уборке) наступает через 35  –  45 дней после высадки растений в грунт. Листья верхнего яруса достигают технической спелости через 80  – 100 дней. Общее количество листьев на одном растении составляет от 20  – 50 штук [7].

Семена табака прорастают при 10 – 12 оС. Оптимальная температура для роста и развития 20 – 25 оС. Осенью табак способен переносить понижения температуры до минус 2 – 3 оС. Более низкие температуры убивают растения. Для получения высокого урожая хорошего качества необходимо бесперебойное снабжение растений водой. Недостаток воды ведет к задержке роста, листья подгорают, снижается продуктивность и ухудшается качество. Оптимальной влажностью почвы является 80 – 75%.

 Рис. 1.5. Внешний вид Nicotiana tabacum Keng. [Электронный ресурс]. – Режим доступа к статье: http://www.plantarium.ru/page/image/id/221583.html (дата обращения: 20.01.17)

Табак является светолюбивым растением. Недостаточная освещенность (из-за сорняков) приводит к задержке его роста и развития, к снижению качества продукции. Табак требователен к почвенным условиям. Больше всего подходят почвы легкого механического состава, с водопроницаемой подпочвой с невысоким содержанием гумуса. Для культуры табака, непригодны тяжелые заплывающие, засоленные и заболоченные почвы. Наиболее благоприятна слабокислая или слабощелочная реакция почвенного раствора, хотя растения табака успешно произрастают как на очень кислых (pH 4.7), так и на щелочных почвах (рН 8,5).

Рис. 1.6. Внешний вид Nicotiana tabacum Keng. [Электронный ресурс]. – Режим доступа к статье:  http://www.plantarium.ru/page/image/id/71654.html (дата обращения: 20.01.17)

Агротехнической особенностью табачного растения является то, что выращивание его начинается в парниках или теплицах, а продолжается в поле. Таким образом, технология возделывания табака (N. tabacum), состоит из двух, отличающихся друг от друга этапов – выращивание рассады и возделывание табака в поле [12].

1.3. Практическое использование рода Табак

Главное назначение табака, это изготовление из него курительных сигарет и папирос. Для этого используют листья, в которых содержится от 1% до 4% ядовитого алкалоида никотина и от 5% до 17% органических кислот. Наркотическое действие у курильщиков вызывает содержащийся в табаке, никотин, а аромат – присутствующие в его листьях эфирное масло и смолы.

Никотин, отходы табачного производства, в частности табачную пыль, используют в качестве эффективного средства борьбы с вредными насекомыми, наносящими урон сельскому хозяйству. Особенно успешно табачными ядами борются с огородными и садовыми вредителями. Из табака, получают некоторые химические вещества, необходимые медицине и народному хозяйству, в частности никотиновую и лимонную кислоты. Семена N. tabacum, содержат 30% – 35% жирного масла, которое можно использовать в мыловаренном производстве.

В странах, традиционно выращивающих табак, на значительных площадях, издавна стоит проблема утилизации его стеблей. По большей части их используют в качестве топлива, но не очень хорошего – дым от них довольно неприятен. В Болгарии пробовали их размалывать, а порошок использовать как кормовую добавку для скота, так как в нем содержится до 9% белка. К сожалению, широкого распространения этот прием не получил. Не вышли за пределы опытного производства многочисленные успешные эксперименты выделения белка из стеблей табака.

Кроме масла, в семенах табака, также присутствуют: протеин, жесткое волокно, углеводы и неорганические примеси. Основу табачного масла (около 90%) составляют триглициды. Жирные кислоты, присутствующие в табачном масле: линолеиновая кислота (66% ¬– 76%), олеиновая кислота (17% ¬– 27%), пальметиновая кислота (7% ¬– 10%) и стеариновая (около 3%). Практически все растительные масла являются сырьём для производства лакокрасочных материалов и алкидной смолы. Поэтому масло семян табака в последнее время тоже привлекло к себе внимание промышленных химиков.

По высокому проценту ненасыщенных кислот масло табака можно сопоставить с маслом семян винограда. А это предполагает потенциальное применение табачного масла в пищевой промышленности [25].

Табак, выращивается для получения сырья, используемого в табачных изделиях. Основной элемент табака  ¬–  никотин ¬– назван в честь Жана Нико ¬– французского посла в Португалии, в 1560 году приславшего семена табака в Париж. Никотин содержится во всех частях растения, кроме зрелых семян, но наибольшая концентрация ¬– в листьях, которые и являются сырьём для лекарственных препаратов. Сам никотин современная медицина в лечебных целях не использует, зато широко применяет никотиновую кислоту, получаемую при окислении никотина хромовой кислотой. Никотиновая кислота входит в комплекс витамина B. Она используется для лечения диареи, дерматита и других заболеваний кожи, лечения сердца, пищеварительных органов, глоссита, стоматита. Кроме того, никотиновая кислота применяется при осложнениях, встречающихся при лечении сульфамидными препаратами. Сторонники гомеопатии предполагают, табак помогает от морской болезни, различных болей и при эпилепсии [30].

1.4. Культивирование и распространение табака в мире

Археологические изыскания показали, что не только жители дикой сельвы употребляли табак. Таким образом, нюхательный табак (датированный примерно первым веком нашей эры) был найден на территории Мексики.

Также учёные обнаружили, что священнослужители древних майя, чтобы донести свои молитвы и просьбы до ушей великих богов курили табак. Правители ацтеков курили табак, прежде чем объявить свою волю. Церемония курения "трубки мира" была широко распространена во всем Новом Свете. Когда каравеллы Колумба достигли Америки, то одним из первых чудес, увиденных европейцами, было курящее сигары местное население Кубы и Сан-Сальвадора. Путешествуя на примитивных лодках между островами Вест-Индии, эти люди возили табак с собой. Первой курящей женщиной Старого Света стала испанская королева Изабелла, которая получила сигары в подарок от Христофора Колумба.

В 1531 году испанцы заложили первые табачные плантации на Кубе и Гаити, а с 1540 года стали регулярно привозить выращенные и обработанные листья в Испанию.

В последующие два-три десятилетия в Испанию и Португалию были завезены и семена табака. В 1560 году Жоан Никот (Joan Nicot), посланник португальского короля, привез семена табака во Францию и Англию.  Так  Жоан Никот стал одним из самых успешных торговцев табаком и его ярым пропагандистом. Именно в честь Жоана Никота ботаниками назван весь род Табак   –   Nicotiana. В XVII веке табак считался панацеей. В 1885 году листья табака были официально признаны британской фармакологией.  Чтобы покончить с монополией Испании в торговле табаком, англичанин Джон Рольф заложил первую табачную плантацию в Америке. В основном, сначала высаживалась махорка (N. rustica), а затем начал возделываться и курительный табак (N. tabacum). С 1620 года королева Елизавета объявила королевскую монополию на виргинские плантации табака и табачную торговлю. Монополия действовала до 1632 года, после чего лорд Джордж Балтимор выступил с инициативой промышленного выращивания табака.  В Россию привез табак из Голландии Пётр I [11].