W003337 Дипломная работа Влияние старения на механизмы ишемической толерантности почки у крыс

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ 1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3

1. ВВЕДЕНИЕ 5

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10

2.1 Ишемическое ОПП 10

2.1.1 Изменения на клеточном уровне 11

2.1.2 Изменения на органном уровне 15

2.1.3 Изменения на функциональном уровне 18

2.1.4 Восстановление после повреждения 18

2.2 Ишемическое прекондиционирование 20

2.3 Изменения в структуре и функциях почки при старении 24

2.4 Процессы аутофагии 25

2.4.1 Аутофагия и ОПП 27

2.4.2 Аутофагия и старение 28

2.5 Процессы ацетилирования 29

2.5.1 Ацетилирование и ОПП 30

2.5.2 Ацетилирование и старение 31

2.6 Связь ацетилирования белков и аутофагии 31

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34

3.1 Используемые реактивы 34

3.2 Лабораторные животные 34

3.3 Экспериментальная модель 35

3.4 Оценка тяжести ОПП 36

3.5 Определение уровня ацетилирования белков почки 36

3.6 Оценка количества лизосом и аутофаголизосом 37

3.7 Статистическая обработка 38

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 40

4.1 Оценка почечной функции после И/Р и И/Р с предварительным ИПК 40

4.2 Исследование уровня ацетилирования белков 50

4.3 Исследование количества лизосом и аутофаголизосом 61

4.4 Заключение 68

ВЫВОДЫ 70

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 71

БЛАГОДАРНОСТИ 84

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМФ – аденозинмонофосфат

АДФ – аденозиндифосфат

АТФ – аденозинтрифосфат

АФК – активные формы кислорода

БСА – бычий сывороточный альбумин

ИЛ – интерлейкин

И/Р – ишемия/реперфузия

ОПП – острое почечное повреждение

НАД – никотинамидадениндинуклеотид

ПНПМ – пора неспецифической проницаемости митохондрий

СКФ – скорость клубочковой фильтрации

ФНО-α – фактор некроза опухоли-альфа

AMPK – 5'-АМФ-активируемая протеинкиназа

Atg – ген, связанный с аутофагией

BAD - Bcl-2-ассоциированный белок смерти

BAX – Bcl-2-ассоциированный белок Х

Bcl-2 – белок 2 В-клеточной лимфомы

CD – кластер дифференцировки

DMEM – Дальбеко модифицированная среда Игла

GSK-3β – 3β-изоформа киназы гликогенсинтазы

eNOS – эндотелиальная NO–синтаза

HAT – гистоновая ацетилтрансфераза

HBO1 – гистоновая ацетилтрансфераза, связывающая комплекс узнавания ориджина-1

HDAC – гистоновая деацетилаза

HIF – фактор, индуцируемый гипоксией

Hsp – белок теплового шока

Ig – иммуноглобулин

JADE1S – ген апоптоза и дифференцировки-1

JAK – Янус-киназа

KDIGO – улучшение глобальных результатов лечения заболеваний почек

Kim–1 – молекула повреждения почек–1

L-FABP – белок, связывающий жирные кислоты, печеночная форма

MDRD – изменение диеты при почечных заболеваниях

MHC – главный комплекс гистосовместимости

mTOR – мишень рапамицина у млекопитающих

mTORC1 – комплекс 1 мишень рапамицина у млекопитающих

NGAL – липокалин, ассоциированный с желатиназой

PARL – пресенилин-ассоциированный ромбоидоподобный белок

PBS – фосфатно-солевой буфер

PI3K – фосфоинозитид-3-киназа

PINK1 – PTEN-индуцируемая киназа 1

RISK – reperfusion injury salvage kinase

SAFE – survivor activating factor enhancement

SIRT – сиртуин

STAT – сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции

TCR – Т-клеточный рецептор

ULK1 – UNC51-подобная киназа

UT – транспортер мочевины

1. ВВЕДЕНИЕ

Острое почечное повреждение (ОПП) определяют как потенциально обратимое острое прекращение жизнеобеспечивающей функции почек, со-провождающееся нарушениями водно-электролитного, азот-выделительного и кислотно-щелочного гомеостаза у прежде здоровых людей [36].  

Наибольшая частота встречаемости ОПП наблюдается у больных в критическом состоянии и ассоциируется у данной категории людей с очень высокой летальностью [34]. В целом, смертность зависит от этиологии и тя-жести ОПП, характера основной и сопутствующей патологии, возраста боль-ных, от особенностей организма, например, наличия или отсутствия ожире-ния. Фактором риска является такие сопутствующие патологии как сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, хронические заболевания печени, опухоли, проведенные хирургические вмешательства. Также риск развития ОПП повышается при синдроме длительного сдавления, уменьшении объема циркулирующей крови и при уже ранее случавшемся почечном повреждении [15].

Согласно последним международным рекомендациям по Улучшению Глобальных Результатов Лечения Заболеваний Почек (Kidney Disease: Improving Global Outcomes - KDIGO), ОПП – это состояние, влияющее на структуру и функцию почек, при котором наблюдается одно или несколько из следующих явлений [118]:

• Повышение креатинина сыворотки на ≥ 0,3 мг/дл (≥ 26,5 мкмоль/л) в течение 48 часов;

• Повышение креатинина сыворотки более чем в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем (если это известно, или предполагается, что это про-изошло в течение предшествующих 7 дней);

• Объем мочи <0,5 мл/кг/час за 6 часов.

Заболеваемость ОПП в общей популяции, по разным оценкам, состав-ляет 3000-5000 человек на миллион населения [22]. То есть ежегодно с этим состоянием сталкиваются 13,3 миллиона человек, и умирает 1,7 миллиона [16].

ОПП признается одним из самых серьезных осложнений у госпитали-зированных людей: с ним сталкивается 21% больных [22, 192]. Чаще всего данное состояние наблюдается у пациентов в палатах интенсивной терапии, там встречаемость составляет 32%, а смертность достигает 27% [26].

Особый интерес представляют пожилые пациенты. Средний возраст развития ОПП в развитых странах составляет 64 года, и возраст пациентов с данной патологией постоянно увеличивается [22]. По крайней мере две трети больных уже переступают рубеж 65 лет, когда сталкиваются с почечным по-вреждением. По сравнению с молодыми людьми, пожилые пациенты обла-дают большим риском развития ОПП, более высокой смертностью и более длительным периодом восстановления [13]. В том числе, пожилым чаще на-значают лекарственные препараты, токсичные для почечной ткани, а также они чаще прибегают к хирургической помощи [24].

 Некоторые авторы предполагают, что почечная ткань в пожилом воз-расте уже не может считаться интактной, т.к. со старением наблюдается структурные, функциональные и молекулярные изменения, что уменьшает физиологический резерв и увеличивает восприимчивость к повреждению [24]. Происходит ряд изменений, включающих в себя уменьшение количест-ва функционирующих гломерул, уменьшение скорости клубочковой фильт-рации и почечного кровотока, ухудшение вазодилатации и выработки оксида азота. Также сопутствующие заболевания, такие, как сердечная недостаточ-ность, гипертоническая болезнь, сахарный диабет, ассоциированы с хрониче-ским ухудшением функции почек. Поэтому, по сравнению с молодыми людьми, пожилые больше подвержены развитию ОПП, и более легкое воз-действие способно вызвать повреждение почки [9]. Почечная ткань у таких пациентов легче повреждается и хуже восстанавливается [24].

Чаще всего ОПП является следствием таких состояний как сепсис, сер-дечная недостаточность, острый инфаркт миокарда, пневмония, а также час-то встречается в постоперационном периоде [192]. В зависимости от меха-низма уменьшения фильтрационного давления в клубочках, выделяют три формы ОПП: преренальную, ренальную и постренальную. Преренальная форма встречается чаще всего, примерно в 40-70% случаев. Она возникает при уменьшении давления крови в приносящей артериоле, что может быть вызвано уменьшением сердечного выброса, потерей крови, обезвоживанием, системной вазодилатацией, стенозом или тромбозом почечной артерии [36]. Данная форма ассоциирована с гипоперфузией ткани, и, в случае сильного падения кровотока, возникает состояние ишемии, которое при восстановле-нии кровотока сменяется состоянием реперфузии [3].

Ренальная форма связана с непосредственным повреждением почечной ткани. Она может быть вызвана ишемией, нефротоксическими веществами, миоглобинурией при рабдомиолизе или гемоглобинурией при гемолизе, а также при воспалительных заболевания почек, сепсисе, обширных травмах, операциях на сердце или при пересадке почки. На ренальную форму прихо-дится 25-40% случаев. Самая малая доля встречаемости принадлежит по-стренальной форме, на нее приходится лишь 5% случаев. Основная причина - обструкция мочевыводящих путей, которая может быть следствием пораже-ния мочевого пузыря, уретры или мочеточников [36].

В отличие от внутреннего поражения почки, своевременная реверсия преренальных и постренальных причин обычно приводит к быстрому вос-становлению функции органа. В случае длительного действия этих этиологи-ческих факторов происходит повреждение почечной паренхимы и, следова-тельно, переход пре- и постренальной формы ОПП в ренальную [36].

Т.к. ишемическое повреждение является самым распространенным по-вреждающим фактором при ОПП [21], разрабатываются методы достижения ишемической толерантности почки. Одним из таких методов является ише-мическое прекондиционирование. Его эффективность показана на многих экспериментальных системах в различных органах, в том числе в почке [114]. Однако, при проведении клинических испытаний данный метод не всегда показывает целесообразность применения у пациентов с ОПП [27, 182]. В связи с тем, что ОПП чаще всего встречается у людей в пожилом возрасте [22], следовало выяснить, сохраняет ли ИПК свои положительные свойства на старых организмах.

Ключевыми характеристиками, меняющимися при старении, являются процессы ацетилирования и аутофагии [142]. Во многих модельных организ-мах подходы, направленные на снижение ацетилирования белков (путем ак-тивации деацетилаз) и активацию аутофагии, служат основными методами продления продолжительность жизни лабораторных животных [19].

Целью данной работы было исследование роли процессов ацетилиро-вания и аутофагии в механизме формирования ишемической толерантности почки, а также влияния на эти процессы старения.

Задачи:

1. Определение тяжести ОПП у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после ише-мии/реперфузии (И/Р) и после И/Р с предварительным ИПК;

2. Исследование с помощью метода иммунофлуоресценции уровня ацетилирования в ткани почки у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после И/Р и по-сле И/Р с предварительным ИПК;

3. Исследование при помощи витальной окраски флуорес-центными зондами (краситель LysoTracker Green) интенсивности про-цессов аутофагии в ткани почки у разных групп крыс (молодые, старые и линии OXYS) при различных воздействиях – после И/Р и после И/Р с предварительным ИПК;

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Ишемическое ОПП

Несмотря на многообразие причин развития ОПП, основным пора-жающим фактором в большинстве случаев является ишемическое поврежде-ние [21]. Исходя из клинических данных, в 55-75% случаев ОПП именно ишемическое повреждение служит причиной возникновения острого каналь-циевого некроза. Чаще всего с ишемическим ОПП сталкиваются пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями, шоком или после хирургических опе-раций. Отдельную группу представляют реципиенты почечных транспланта-тов, т.к. пересаживаемые почки неизбежно проходят этап ишемии [14].

Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) и почечный кровоток - ауто-регулируемые процессы, и они не зависят от системного кровотока при арте-риальном давлении в диапазоне 80-170 мм рт.ст. Однако, при падении давле-ния ниже 80 мм рт.ст., механизмы ауторегуляции не могут поддерживать разницу давления между приносящей и выносящей артериолами, что приво-дит к уменьшению кровотока в клубочках. Невозможность поддержания эф-фективного фильтрационного давления ведет к прекращению фильтрации в клубочках. Снижение кровотока влияет также на функцию реабсорбции. Не-достаточное поступление кислорода связано со снижением образования аде-нозинтрифосфата (АТФ), который необходим для поддержания работы Na+/K+-АТФ-азы, создающей градиент ионов между эпителиальной клеткой и интерстицием. Созданный градиент является основой вторично-активного транспорта, за счет которого происходит реабсорбция различных веществ и воды. Нарушение фильтрации и реабсорбции будет вести к накоплению в крови метаболитов, которые в норме выводятся с мочой, например, мочеви-ны и креатинина [37, 82].

Процессы, происходящие в течение ишемии и последующей реперфу-зии, неразрывно связаны между собой, поэтому нередко их обозначают как ишемически-реперфузионное (И/Р) повреждение [166].

2.1.1 Изменения на клеточном уровне

Одну из первостепенных ролей в процессах ишемии и реперфузии, а также вызываемых ими повреждений играют митохондрии. При нормальной оксигенации и достаточной концентрации субстрата на дыхательной цепи происходит выработка АТФ [25]. Помимо АТФ, митохондрии также являют-ся источниками активных форм кислорода (АФК). Выработка АФК осущест-вляется комплексами дыхательной цепи, дегидрогеназами в матриксе и мо-ноамин-оксидазами внешней митохондриальной мембраны [163]. В физиоло-гических условиях их количество строго контролируется несколькими анти-оксидантными системами, интенсивность работы которых зависит от типа ткани, функциональной активности и состояния органа. Неконтролируемое образование большого количества АФК наносит урон митохондриям и клет-ке, но их продукция в ряде случаев несет полезные функции, например, они участвуют в передаче внутриклеточных сигналов, играют роль в клеточном иммунитете [194].

При прекращении доставки кислорода к клеткам происходит переклю-чение окислительного фосфорилирования, протекающего в митохондриях, на субстратное, которое не требует участия кислорода. Однако, поддержание нормальных функций только за счет АТФ, полученного в результате процес-са гликолиза, невозможно для ткани с высоким метаболизмом. Уровень АТФ в клетке постепенно падает, идет накопление лактата. Понижение рН и уменьшение количества АТФ приводят к дестабилизации мембран лизосом и разрушению гидролазами части клеточных структур. Ингибируется работа ионных помп, в частности, Na+/K+-АТФ-азы, за счет чего в клетке нарушает-ся соотношение ионов. Возрастание внутриклеточной концентрации ионов натрия ведет к нарушению работы Na+/Ca2+-антипортера и приостановке пе-реноса ионов кальция в межклеточное пространство. Еще один путь накоп-ления Ca2+ в цитоплазме – прекращение его активного транспорта в эндо-плазматический ретикулум из-за нехватки АТФ для нормальной работы ка-налов [4].

Накопление ионов кальция является важным звеном в развитии по-следствий ишемии. В частности, повышение их концентрации приводит к ак-тивации Ca2+-зависимых протеаз - кальпаинов. Низкий рН временно ингиби-рует кальпаины, но при его нормализации происходит их немедленная акти-вация [103]. Также накопление Na+ и Ca2+ в клетке приводит к вынужденному удерживанию ионов кальция в матриксе митохондрий. Повышение количест-ва данных ионов внутри митохондрии приводит к конкурентному взаимодей-ствию с сайтом связывания кардиолипина и цитохрома с и активации первого шага высвобождения цитохрома с в процессе открытия поры неспецифиче-ской проницаемости митохондрий (ПНПМ). Отсоединение цитохрома с от внутренней мембраны за счет этих двух процессов приводит к замедлению транспорта электронов с комплекса III на комплекс IV дыхательной цепи, и возрастанию образования АФК в Q-цикле [76]. Таким образом, повышенный синтез АФК может проявляться даже раньше, чем выход цитохрома с из ми-тохондрии [159].

В целом, процесс ишемии не ведет к глобальной гибели клеток, основ-ной урон наносится ткани в период реперфузии. Например, на сердечной ткани показано, что 4 часа ишемии вызывают гибель только 17% миокардио-цитов, тогда как после 3 часов ишемии и последующей реперфузией в тече-ние 1 часа гибнет 73% клеток [101].

В период реперфузии наблюдается резкое увеличение образования АФК. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (напри-мер, при гипоксии) в ней, кроме четырехэлектронного восстановления ки-слорода на цитохром с-оксидазе, также возможно одноэлектронное восста-новление, ведущее к накоплению супероксидного радикала. Этот метаболит является высокореакционным соединением, которое при протонировании может образовывать пероксильный радикал или самостоятельно осуществ-лять окисление макромолекул [184]. Есть данные, показывающие ингибиро-вание супероксидным радикалом ферментов, содержащих железо-серные кластеры в активном центре, такие, как аконитаза, фумараза, НАДН-дегидрогеназа, креатинкиназа [110]. Он принимает участие в кальциевом сигналинге в артериолах почки и усиливает вазоконстрикцию, вызванную ангиотензином II, эндотелином-1 и тромбоксаном А2 [4]. Это связано с реак-цией связывания оксида азота с супероксидным радикалом и образованием пероксинитрита. Также супероксид-анион увеличивают вход кальция через каналы L-типа [184]. Кроме того, возможно дальнейшее преобразование су-пероксид анион-радикала, дающее начало целому ряду АФК. Таким образом, после возобновления поступления кислорода происходит лавинообразное на-копление в клетке АФК, которые повреждают липиды, белки и нуклеиновые кислоты [35].

Одним из механизмов повреждения митохондрий является открытие ПНПМ [33]. Данная пора является неселективным каналом, который играет значительную роль в кальциевом обмене между митохондриями и цитоплаз-мой. Открытие ПНПМ индуцируется Ca2+  при его повышенном накоплении в митохондрия и циклофиллином D, который активируется ионами кальция [39]. Индукторами ПНПМ также являются АФК, увеличение аденозинди- и монофосфатов (АДФ и АМФ), снижение мембранного потенциала, проапоп-тотические белки семейства 2 В-клеточной лимфомы (B-cell lymphoma 2 - Bcl-2), возбуждающие аминоксилоты, стероидные гормоны [91].

Выброс Ca2+ через пору является механизмом, предотвращающим пе-регрузку митохондрий ионами кальция и гиперпродукцию АФК. Однако, от-крытие ПНПМ также облегчает выход цитохрома с в цитоплазму, что приво-дит к апоптозу [108]. Хотя пока не все белковые структуры и элементы, регу-лирующие открытие ПНПМ описаны, показано, что существует один, отве-чающий за активацию/деактивацию комплекса. Этим белком является 3β-изоформа киназы гликогенсинтазы (glycogen synthase kinase 3-beta, GSK-3β). Активации данной киназы путем дефосфорилирования серина в 9 положении ведет к открытию ПНПМ, тогда как ингибирование предотвращает образова-ние поры [25].

Значительное падение кровотока или его полная остановка ведет к пре-кращению снабжения ткани кислородом и питательными веществами. В норме ткани имеют определенный запас питательных веществ, которые мо-гут окисляться, пока еще есть некоторый резерв кислорода. Как было показа-но, клетки способны выживать даже после длительной ишемии и возвра-щаться к выполнению своих физиологических функций [101]. Этот период, в течение которого ткань способна нивелировать последствия гипоксии, назы-вают толерантностью ткани к ишемическому повреждению. Длительность данного периода очень специфична для каждого органа. Это окно очень зна-чимо для разработки терапевтической тактики, в данный момент идут разра-ботки методов его увеличения [25].

В целом, нарушение работы комплексов дыхательной цепи, падение митохондриального потенциала, повышение проницаемости мембран мито-хондрии и высвобождение апоптотических белков приводят к повреждению этих органелл. Результатом является уменьшение количества АТФ, повы-шенное содержание АФК, опосредующих перекисное окисление липидов, белков и ДНК. В итоге, повреждение затрагивает всю клетку. Таким образом, митохондрии играют ключевую роль в развитии повреждения после И/Р и могут служить возможным звеном для терапии ОПП [85].

2.1.2 Изменения на органном уровне

Изменения, протекающие при ишемии/реперфузии, пагубно сказыва-ются на функционировании нефрона. Длительная ишемия и последующая реперфузия ведут, прежде всего, к гибели разных видов клеток почки [34].

Клетки обладают разной чувствительностью к ишемическому повреж-дению. Считается, что самыми уязвимыми являются эндотелиоциты [122]. На фоне И/Р они набухают (уменьшая просвет сосуда), теряют гликокаликс, в них наблюдается разрушение цитоскетета, плотных контактов и потеря взаи-модействия с периваскулярным матриксом, изменяется экспрессия генов [3]. К тому же, И/Р вызывает вазоконстрикцию за счет стимуляции выработки эндотелием тромбоцитарного фактора роста и эндотелина-1 [83]. Вазоконст-рикция усиливается и за счет снижения выработки оксида азота в период ре-перфузии, которое наблюдается из-за уменьшении экспрессии eNOS (endothelial nitric oxide synthase) и других вазодилатирующих эндотелиаль-ных факторов, а также в результате образования пероксинитрита [124]. После ишемии повышается восприимчивость эндотелия к эндогенным вазоконст-рикторам, таким как ангиотензин II, тромбоксан А2, простагландин Н2, лей-котриены С4 и Д4 [3].

Клетки нефрона по-разному реагируют на изменения оксигенации. Это связано с тем, что в норме в нефроне существует градиент парциального дав-ления кислорода [81]. Наблюдается разность метаболической активности в разных участках нефрона, например, может по-разному происходить метабо-лизм жирных кислот, быть различной интенсивность образования лактата [46], кетоновых тел и аминокислот [4]. В связи с этим некоторые участки нефрона адаптированы к пониженным концентрациям кислорода. Есть дан-ные, показывающие что эпителий внутреннего мозгового вещества мало за-висит от окислительного фосфорилирования и получает АТФ преимущест-венно за счет гликолиза [59]. Эпителиальные клетки внешнего коркового ве-щества тоже имеют большой запас кислорода, поэтому этот регион является одним из самых устойчивых к повреждению. Наиболее подвержены пораже-нию эпителиоциты внешнего мозгового вещества, т.к. они и при физиологи-ческих условиях находятся на грани аноксии, но при этом вынуждены актив-но выполнять функции реабсорбции. Там же обнаруживают наибольшее ско-пление клеток иммунной системы после реперфузии [98]. Участок, наиболее чувствительный к повреждению – S3-сегмент [133]. Однако, несмотря на разную чувствительность, при очень длительной ишемии страдают все об-ласти почки [4].

Основными морфологическими изменениями, происходящими в эпите-лиоцитах при И/Р, являются потеря щеточной каемки и полярности, т.е. на-чинает наблюдаться аномальное распределение трансмембранных белков (интегрины, Na+/K+-АТФ-аза) [49]. Клетки слущиваются, оголяя базальную мембрану, в просвете канальцев накапливается дебрис с появлением слепков, вызывающих его обструкцию и повышение внутриканальцевого давления [3].

Повреждение эндотелия и эпителиоцитов ведет к активации экспрессии молекул адгезии, которые узнают тромбоциты и клетки иммунной системы. Связывание тромбоцитов и лейкоцитов с поврежденными клетками эндоте-лия ведет к образованию микротромбов, обструкции капилляров и активации лейкоцитов с усилением выработки цитокинов [111]. Погибшие клетки яв-ляются триггером для развития воспаления, в ответ на их обнаружение начи-нают образовываться провоспалительные и хемотаксические цитокины (ФНО-α, ИЛ1, ИЛ6, ИЛ8 и другие) [57]. Клетки почечной ткани, оказавшись в зоне воспаления, также начинают вырабатывать провоспалительные цито-кины и экспрессировать TLRs, белки и рецепторы системы комплемента, костимулирующие молекулы. На их поверхности появляются рецепторы MHCII, презентирующие антигены Т-клеткам [3].

Первыми в очаг повреждения привлекаются клетки врожденного им-мунитета – нейтрофилы [45]. Несмотря на то, что присутствие нейтрофилов необходимо для фагоцитоза погибших клеток и дальнейшего привлечения клеток иммунной системы, они опосредуют еще большее повреждение по-чечной ткани. В процессе активации они производят протеазы, миелоперок-сидазу, АФК и цитокины, которые увеличивают проницаемость сосудов и могут нарушать целостность вышивших клеток [4]. Нейтрофилы привлекают другие клетки, в первую очередь, моноциты, которые в очаге воспаления превращаются в макрофаги. Их появление в ткани регистрируют через 30 минут после начала реперфузии, максимум численности наблюдают через 24 часа, а значительное уменьшение через 7 суток [130]. Макрофаги выполняют свою основную функцию, фагоцитируют разрушенные клетки, а также уча-ствуют в презентации антигенов [112]. Присутствие макрофагов в повреж-денном участке важно для его репарации, однако, у мышей их подавление в почке и селезенке до И/Р уменьшало тяжесть ОПП, а перенос макрофагов от контрольной мыши возвращал исходные показатели [3].

Затем идет активация адаптивного ответа, происходит созревание Т- и В-лимфоцитов. Их присутствие, как и макрофагов, ухудшает показатели по-чечных функций, но играет важную роль в репарации после И/Р [136]. На-пример, мыши, дефицитные по CD4 и CD8, через двое суток после И/Р обла-дали меньшей тяжестью ОПП, меньшим инфильтрированием ткани нейтро-филами и значительным уменьшением острого канальциевого некроза [165]. Другое исследование показало улучшение гистологической картины и серо-логических показателей только у мышей с дефицитом Т-клеток или Т-хелперов, отсутствие CD8+-клеток не обладали функциональными или структурными маркерами повреждения [60]. Также было проведено исследо-вание нокаута Т-клеточных рецепторов – αß-TCR. Мыши с дефектом αß-TCR через 24 часа после И/Р по значению креатинина были защищены от повреж-дения, по сравнению с интатными животными [100].

Аналогично, В-лимфоциты также играют двоякую роль при И/Р почки [137]. Мыши с нокаутом рецептора комплемента 2-го типа обладали нефунк-циональной субпопуляцией В1, и поэтому более низким содержанием IgM, что было ассоциировано с меньшим повреждением при И/Р [44]. Несмотря на то что многие исследования связывают действие лимфоцитов с поражением ткани в процессе ишемически-реперфузионного повреждения, они также участвуют в восстановлении ткани почки [137].

2.1.3 Изменения на функциональном уровне

Ишемическое ОПП ассоциировано с такими состояниями как острый канальциевый некроз, уменьшение скорости клубочковой фильтрации, уве-личение креатинина сыворотки крови и олигурия [3]. Серьезные изменения происходят в сосудистом русле почки после И/Р. За счет повреждения эндо-телия, увеличения базального тонуса сосудов, привлечения тромбоцитов и лейкоцитов наблюдаются такие последствия как уменьшение кровотока и СКФ, удлинение периода ишемии в отдельных участках почки [111].

За счет поражения эндотелиоцитов страдает фильтрационная функция и реабсорбция [112]. Поврежденные проксимальные канальцы не способны должным образом реабсорбировать ионы натрия, в связи с чем плотное пятно дистального отдела нефрона активирует тубуло-гломерулярную обратную связь, происходит сужение приносящей артериолы и наблюдается еще боль-шее падение СКФ [17].

2.1.4 Восстановление после повреждения

Если повреждающий фактор воздействует короткое время и физиоло-гические резервы почечной ткани не истощены, есть вероятность восстанов-ления почки без ухудшения ее функционирования [34]. Есть несколько типов клеток, которые могли бы пролиферировать в ответ на повреждение почки, - выжившие эпителиальные клетки, стромальные клетки костного мозга, внут-рипочечные прогениторы или интерстициальные клетки [4, 109]. Исследова-ния, проведенные на трансгенных мышах показывают, что именно выжив-шие эпителиальные клетки ответственны за восполнение необходимого ко-личества клеток канальцев после И/Р [77]. Пораженные элементы в этом слу-чае удаляются, эпителиоциты в нефронах дедифференцируются, делятся не-обходимое число раз до восполнения численность клеток в нефроне, и вос-станавливают свою дифференцировку. Маркеры при восстановлении анало-гичны тем, что участвуют в органогенезе почки, и их активность не наблюда-ется в органе в норме [78].

Несмотря на большое количество изменений, происходящих в почеч-ной ткани при И/Р, возможно два исхода. Один из них заключается в восста-новлении поврежденной ткани, другой – в замещении погибших участков фиброзной тканью [111].

При остром повреждении почечной ткани нормальное функционирова-ние эпителиоцитов и эндотелия нарушается. При длительном или тяжелом повреждении погибает большое количество клеток, развивается сильный воспалительный ответ [3]. В поврежденных клетках почки из-за повреждений останавливается клеточный цикл на стадии G2/M [190]. Привлеченные клет-ки иммунной системы и эпителиоциты начинают вырабатывать провоспали-тельные цитокины и факторы роста. Развивается воспалительный процесс, стимулирующий фибробласты к активному делению. Перициты мигрируют от сосудов, повышая проницаемость сосудов и тем самым усугубляя эндоте-лиальную дисфункцию [3]. Сосуды еще больше повреждаются, это ведет к потере микроциркуляторной сети и ухудшению кровоснабжения ткани. Уменьшение количества сосудов ассоциировано с хронической гипоксией, которая пролонгирует канальцевое повреждение и тубулоинтерстициальный фиброз [50]. Новые капилляры не образуются, т.к. идет угнетение синтеза ан-гиогенных факторов и усиление выработки ингибиторов ангиогенеза [51].

Создается порочный круг, фибробласты постепенно замещают повреж-денную ткань и еще больше угнетают кровоток. Нарушение доступа кисло-рода и питательных веществ к клеткам канальцев мешает регенеративному процессу и приводит к еще большему фиброзу. Данные изменения уменьша-ют количество функционирующих нефронов и ведут к развитию хрониче-ской болезни почек [15;22]. Особенно часто фиброз выявляют при хрониче-ском почечном повреждении или в почках пожилых пациентов [34].

На важность пролиферативной способности клеток при репарации по-сле повреждения еще раз указывают данные о роли длины теломер в регене-рации после И/Р-повреждения. Мыши, дефицитные по участку РНК в тело-меразе и, соответственно, имевшие в каждом поколении уменьшающуюся длину теломер, обладали меньшей пролиферативной способностью к восста-новлению клубочков, канальцев и интерстициальных клеток после повреж-дения [7].